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        上??婆d介紹蛋清溶菌酶操作步驟

        發(fā)布日期: 2014-03-31
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        ()蛋清溶菌酶的分離提取

        1.變性與等電點(diǎn)選擇性沉淀:取新鮮蛋清用1%NaCl-0.05mol/LHCl 溶液攪拌稀釋,加20%HAc 調(diào)pH4.6,3000r/min 離心10min,收集濾液并記錄體積,留樣2mL()待分析。將濾液置于沸水浴使3min 內(nèi)迅速升溫75℃,用流動水速冷后,3000r/min 離心20min,收集上清液,紀(jì)錄體積,并留樣2mL()待分析。

        2.丙烯酸處理:將所得清液(pH6.0左右)中滴加10%聚丙烯酸(用量為清液體積的1/4),慢速攪拌,當(dāng)凝聚物出現(xiàn)后,靜置30min 使凝聚物粘附于容器底部。傾去上清液,加入蒸餾水約1mL,并滴加少量0.5mol/LNa2CO3,使沉淀溶解,此時(shí)溶液pH6左右。攪拌條件下向溶液中滴加500g/LCaCl2(體積為聚丙烯酸量的1/12.5),生成的沉淀擠壓干后棄去。如所得溶液不夠澄清,可以進(jìn)行離心或簡單過濾,并用少量水洗滌濾紙。收集濾液于刻度試管,記錄體積,留樣0.5mL()待分析。

        3.Sephadex G-50 柱層析

        (1)裝柱:稱取15g Sephadex G-50,加入300mL 蒸餾水溶脹6小時(shí)以上,置熱水浴中加熱除去氣泡,冷卻后裝入玻璃層析柱。用6g/LNaCl 溶液200mL 平衡層析柱。

        (2)上樣:向樣液中加入固體NaCl 使終濃度為50g/L,上樣時(shí)先吸去層析柱凝膠面上的溶液,再沿管壁滴加樣品,樣品量不宜超過10mL。加完后打開層析柱出口,讓樣品均勻流入凝膠內(nèi)。

        (3)洗脫:樣品流完后,先分次加入少量6g/LNaCl 洗脫液洗下柱壁上的樣品,然后接通蠕動泵,繼續(xù)6g/LNaCl 洗脫,調(diào)節(jié)操作壓力使流速控制在7~8mL/10min,部分收集器收集,10min 一管,共收集200mL 左右。

        (4)分析:紀(jì)錄各管體積,紫外光吸收法測定各管中蛋白質(zhì)濃度。合并含有蛋白質(zhì)的收集管,草酸鑒定Ca2+ ,留樣()待分析。

        4.乙二醇濃縮:將洗脫液放入透析袋,外面裹以聚乙二醇,置于加蓋容器中。當(dāng)酶液水分被聚乙二醇吸收而濃縮5mL 左右時(shí),用蒸餾水洗去透析膜外的聚乙二醇,倒出濃縮液,記錄體積,留樣

        0.5mL()待分析。

        ()溶菌酶活力測定

        取上述各待測酶液稀釋30~50倍,進(jìn)行酶活測定。用微量進(jìn)樣器取酶液樣品10μL,加入0.5mL 0.5mol/L 磷酸緩沖液(pH6.5),混合均勻,37℃預(yù)熱2min,然后加入同樣已預(yù)熱過的菌懸液0.5mL。37℃保溫反應(yīng)15min 后,用2mL 乳化劑停止反應(yīng)。
        反應(yīng)液經(jīng)3000r/min 離心10min,取清液在721型分光光度計(jì)上進(jìn)行比色(540nm)??瞻坠苡昧姿峋彌_液替代樣液。

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