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        動(dòng)物基因組DNA的提取

        發(fā)布日期: 2016-03-04
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        動(dòng)物基因組DNA的提取

        實(shí)驗(yàn)簡介

            DNA是遺傳信息的載體,是重要的生物信息分子,是分子生物學(xué)研究的主要對象,為了進(jìn)行測序、雜交、基因表達(dá)、文庫構(gòu)建等實(shí)驗(yàn),獲得高分子量和高純度的基因組DNA是非常重要的前提,因此基因組DNA的提取也是分子生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)中重要、基本的操作之一。

        實(shí)驗(yàn)原理、目的

            DNA是遺傳信息的載體,是重要的生物信息分子,是分子生物學(xué)研究的主要對象,為了進(jìn)行測序、雜交、基因表達(dá)、文庫構(gòu)建等實(shí)驗(yàn),獲得高分子量和高純度的基因組DNA是非常重要的前提,因此基因組DNA的提取也是分子生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)中重要、基本的操作之一。 染色體存在于細(xì)胞核中,外有核膜及胞膜。從組織中提取DNA必須先將組織分散成單個(gè)細(xì)胞,然后破碎胞膜及核膜,使染色體釋放出來,同時(shí)去除與DNA結(jié)合的組蛋白及非組蛋白。 整個(gè)實(shí)驗(yàn)可分為細(xì)胞裂解、DNA分離與純化和DNA的洗脫收集。

        實(shí)驗(yàn)步驟

             1、取新鮮或冰凍動(dòng)物組織塊0.1g(0.5cm3),盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中,加入1ml的細(xì)胞裂解緩沖液勻漿不見組織塊,轉(zhuǎn)入1.5ml 離心管中,加入蛋白酶K (500ug/ml)20μl,混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min,也可轉(zhuǎn)入37℃水浴12~24h,間歇振蕩離心管數(shù)次。于臺式離心機(jī)以12000 rpm離心5min,取上清液入另一離心管中。

             2、加2倍體積異丙醇,倒轉(zhuǎn)混勻后,可以看見絲狀物,用100ul 吸頭挑出,涼干,用200ul TE 重新溶解。(可進(jìn)行PCR反應(yīng)等,需要進(jìn)一步純化的按下列步驟進(jìn)行)

             3、加等量的酚:氯仿:異戊醇振蕩混勻,離心12000 rpm,5min。

             4、取上層溶液另一管,加入等體積的氯仿?異戊醇,振蕩混勻,離心12000 rpm,5min。

             5、取上層溶液另一管,加入1/2體積的7.5mol/L乙酸氨加入2倍體積的無水乙醇,混勻后室溫沉淀2min ,離心12000 rpm ,10min。

             6、小心倒掉上清液,將離心管倒置于吸水紙上,將附于管壁的殘余液滴除掉。

             7、用1ml 70%乙醇洗滌沉淀物1次,離心12000 rpm , 5min。

             8、小心倒掉上清液,將離心管倒置于吸水紙上,將附于管壁的殘余液滴除掉,室溫干燥。

             9、加200ul TE重新溶解沉淀物,然后置于4℃或?C20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

             10、吸取適量樣品于GeneQuant上檢測濃度和純度。

        常見問題

        1、盡量簡化操作步驟,縮短提取過程。

        2、減少化學(xué)因素對核酸的降解。

        3、減少物理因素對核酸的降解:機(jī)械剪切力和高溫。

        4、防止核酸的生物降解:排除核酸酶。

         

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