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        簡述細胞培養(yǎng)的步驟

        發(fā)布日期: 2016-06-03
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        細胞培養(yǎng)技術也叫細胞克隆技術,在生物學中的正規(guī)名詞為細胞培養(yǎng)技術?,F代生物技術一般認為包括基因工程技術、細胞工程技術、酶工程技術和發(fā)酵工程技術,而這些技術的發(fā)展幾乎都與細胞培養(yǎng)有密切關系,特別是在醫(yī)藥領域的發(fā)展,細胞培養(yǎng)更具有特殊的作用和價值。以下來具體講一下細胞培養(yǎng)的步驟。

            細胞培養(yǎng)的步驟

            一、細胞復蘇:

            1. 將新鮮培養(yǎng)基置于37℃水浴鍋中回溫,回溫后噴以75%酒精并擦拭之,移入無菌操作臺內。如配置:50mL*培養(yǎng)基(含10%FBS,1%青鏈霉素雙抗)44.5mL基礎培養(yǎng)基 + 5mL FBS + 0.5mL青鏈霉素雙抗。

            2. 戴防護手套后,自液氮罐中取出冷凍管,檢查蓋子是否旋緊,立即放入37℃水槽中快速解凍(避免冰晶重新結晶而造成細胞死亡),輕搖冷凍管使其在2分鐘內全部融化,以75%酒精擦拭保存管外部,移入無菌操作臺內。

            3. 將解凍的1mL細胞懸液緩緩加入細胞培養(yǎng)瓶內,再向瓶中加入10mL*培養(yǎng)基(稀釋比例為1:10),混合均勻,放入37℃,5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取0.1ml解凍細胞懸液作存活測試。(Sf9細胞在27℃生長,可不需CO2)

            4. 一般而言,細胞大都不需立即去除冷凍保護劑(例如DMSO)。若要立即去除,則將解凍的細胞懸液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內,離心1300rpm,5分鐘,移去上清液,加入新鮮培養(yǎng)基,混合均勻,放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。若不需立即去除冷凍保存劑,則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。

            二、傳代培養(yǎng):

            1. 37℃恒溫培養(yǎng)約48小時,待細胞長滿80-90%后,從培養(yǎng)箱取出75cm2培養(yǎng)瓶,倒掉培養(yǎng)基。加入5mLPBS緩沖液吹打以洗去殘留血清,倒掉緩沖液。

            2. 沿壁(無細胞的一面)緩緩加入1mL胰酶溶液消化細胞約1min,輕輕搖晃,倒掉殘余胰酶,將培養(yǎng)瓶置于恒溫箱中約1min,拿出培養(yǎng)瓶輕輕拍打一下細胞貼壁的一面。

            注意:佳消化溫度是37℃,加液后用移液管反復吹打分散細胞。

            3. 向瓶中加入5mL*培養(yǎng)基,反復吹打均勻2min,從中取出20μl0.5ml小離心管中,向管中加入80μl臺盼藍溶液,混勻,從混合液中取出10μl蓋好蓋玻片的計數板上,計算細胞密度及活率。

            4. 將5mL細胞懸液全部吸出,分別接種1mL懸液到原培養(yǎng)瓶和另一新的培養(yǎng)瓶中,其余舍棄。再向兩瓶中各加入10mL*培養(yǎng)基,置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(細胞傳代時按1:5或更大比例稀釋)

            三、細胞計數與存活測試:

            1. 取10μl混合液自血球計數盤chamber上方凹槽加入,蓋上蓋玻片,于100倍倒立顯微鏡下觀察,活細胞不染色,死細胞則為藍色。

            2. 計數四個大方格的細胞總數。計數板計數時,適濃度為5~10×105細胞/ml。高濃度細胞懸液,可取出部分稀釋后計數。

            3. 每一大格的體積為0.1cm×0.1cm×0.01cm= 10-4ml。若細胞位于線上,只計左線與上線的細胞。

            注:細胞密度= 四大格細胞總數×稀釋倍數×104/4= 細胞數/ml;

            細胞活率= 活細胞數/(活細胞數+死細胞數)×100%。                         

            四、細胞凍存:

            1. 冷凍前確保細胞處于指數生長期,傳代后的5mL細胞懸液取出1mL接種到培養(yǎng)瓶繼續(xù)傳代。另取一無菌離心管,將剩余4mL細胞懸液置于其中,離心1000rpm,5min(轉速勿超過1500rpm)。

            2. 離心后倒掉上層清液,收集下層細胞沉淀。向離心管中加入900ul*培養(yǎng)基,用槍頭反復吹打重懸起細胞。取少量細胞懸液計數細胞濃度及凍前存活率。一般細胞濃度為2~5×106cells/ml較適宜。

            3. 將細胞懸液轉入1.5mL無菌凍存管中,再加入100ul試劑級DMSO,混勻,制成細胞凍存懸液(DMSO后濃度為10%)。嚴密封口后,注明細胞名稱、代數、日期,然后進行凍存。

            注意:對Sf9細胞而言,凍存比例為:95%培養(yǎng)液+5%DMSO。

            5. 傳統(tǒng)方法:冷存管置于4℃10分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16~18小時(隔夜)→液氮罐長期儲存。(-20℃勿超過1小時,防止胞內冰晶過大造成細胞死亡)

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