1. 大多數(shù)限制酶貯存在50%甘油溶液中,以避免在-20℃條件下結(jié)冰。當(dāng)終反應(yīng)液中甘油濃度大于12%時(shí),某些限制酶的識(shí)別特異性降低,從而產(chǎn)生星活性,更高濃度的甘油會(huì)抑制酶活性。因此加入反應(yīng)的酶體積不超過反應(yīng)總體積的1/10,避免限制酶活性受到甘油的影響。

2. 濃縮的限制酶可在使用前用1×限制酶緩沖液稀釋,但切勿用水稀釋以免酶失活,用水稀釋的酶不能長期保存。

3. 反應(yīng)體系中Mg2+是限制酶僅有的共同因子,當(dāng)用其它二價(jià)陽離子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA時(shí),酶活性會(huì)被抑制,或改變酶的特異性,導(dǎo)致星型反應(yīng)。

4. 多種因素可引發(fā)星型反應(yīng)：①非適的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶濃度大于25u/ug；④鹽濃度降低；⑤高濃度甘油的存在（>12%）；⑥有機(jī)溶劑的存在。

5. 反應(yīng)混合物中DNA底物的濃度不宜太大,小體積中過高濃度的DNA會(huì)形成粘性DNA溶液抑制酶的擴(kuò)散,并降低酶活性。建議酶切反應(yīng)的DNA濃度為0.1-0.4ug/ul。

6. 酶切反應(yīng)所加入的酶量應(yīng)適中,根據(jù)底物的種類、量的多少和體積的大小而定,對不同的限制酶,各廠家均有一大的消化量指標(biāo)可參考。

7. 當(dāng)要用兩種或兩種以上限制酶切割DNA時(shí),如果這些酶可以在同種緩沖液中作用良好,則兩種酶可同時(shí)切割,如果這些酶所要求的緩沖液有所不同,則可采用以下兩種替代方法：①先用在低離子強(qiáng)度的緩沖液中活性高的酶切割DNA,然后加入適量NaCl及第二種酶,繼續(xù)反應(yīng)；②使用能夠使多數(shù)內(nèi)切酶均表現(xiàn)較高活性的單種緩沖液。

8. 用同一種酶切割不同的DNA時(shí),所需酶量不同,可根據(jù)DNA底物上酶切位點(diǎn)的多少與λDNA存在位點(diǎn)的數(shù)目比較后,決定用酶量。對于超螺旋DNA,基因組DNA、瓊脂糖包埋的DNA,使用的酶單位活性應(yīng)適當(dāng)加大。

9. 反應(yīng)混合液中加入濃度為0.1mg/ml的BSA,可維持酶的穩(wěn)定性。

10.酶切底物DNA應(yīng)具備一定的純度,其溶液中不能含有跡量酚、氯仿、,大于10mM的EDTA,去污劑SDS以及過量的鹽離子濃度,否則會(huì)不同程度地影響限制酶的活性。

11.DNA堿基上的甲基化修飾也是影響酶切的一個(gè)重要因素,所以轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)所選擇的受體菌株應(yīng)考慮到使用的菌株中的酶修飾系統(tǒng)。

12.要保證酶作用時(shí)的佳反應(yīng)條件（ph, 溫度）和底物用量,酶反應(yīng)才能有效地進(jìn)行。

13.反應(yīng)取酶時(shí)應(yīng)使用無菌吸頭,以免污染酶液,同時(shí)應(yīng)盡量縮短酶在溫室的放置時(shí)間。

14.高于37℃或需長時(shí)間保溫時(shí),可加入礦物油覆蓋在反應(yīng)液上以減少水分蒸發(fā)。

15.反應(yīng)混合物混勻時(shí),應(yīng)避免強(qiáng)烈振蕩以保證不使內(nèi)切酶變性及DNA大分子的完整。

16.反應(yīng)前的低速離心是必要的,這可使因混勻吸附于管壁上的液滴全部沉管底。

17.用已硅化的離心管進(jìn)行酶切反應(yīng),可獲得更佳的酶切效果,否則DNA可能粘附于管壁而影響酶切效果。

18.終止酶反應(yīng)可根據(jù)需要采用不同的方法：①酶切后不需進(jìn)行下一步反應(yīng),可加入含EDTA的終止液終止反應(yīng)；②若需進(jìn)一步反應(yīng)（如連接,切割等）,可將反應(yīng)管置65℃保溫20-30分鐘,以滅活酶終止反應(yīng)。③可用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀獲得較純DNA進(jìn)行下一步酶學(xué)操作。

19. 不同廠家的試劑不可混用,需要時(shí)請查明相關(guān)條件及數(shù)據(jù)。