谷*甘肽還原酶活性系數(shù)（GRAC）檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC6005

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前加入1.2mL蒸餾水，充分溶解，2-8℃可保存4周；

2. 試劑三：臨用前取試劑三A加入0.537mL試劑三B，充分溶解，-20℃可分裝保存4周，避免反復凍融；

3. 工作液：臨用前根據(jù)樣本量按照試劑一：試劑二：試劑三：試劑四=40μL：10μL：4μL：10μL（64μL，1T）的比例配制工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配；

4. 試劑五：臨用前加入1.2mL蒸餾水，充分溶解，-20℃可分裝保存4周，避免反復凍融；

5. 試劑五工作液：臨用前根據(jù)樣本量按照試劑五：蒸餾水=5μL：95μL（0.1mL，10T）的比例配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

谷*甘肽還原酶（Glutathione Reductase，GR）是廣泛存在于真核與原核生物中的一種黃素蛋白氧化還原酶，該酶以核黃素衍生物核黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）為輔基，催化NADPH還原氧化型谷*甘肽（G SSG）生成還原型谷*甘肽（GSH），維持巰基和膜蛋白處于還原狀態(tài)。當生物體內(nèi)缺乏核黃素時，FAD含量相應減少，GR活性也隨之降低，谷*甘肽還原酶活性系數(shù)（GR Activation Coefficient，GRAC）迅速升高，出現(xiàn)唇炎、口角炎、結(jié)膜炎等臨床癥狀。因此，GRAC用于核黃素營養(yǎng)狀況評價，對于早期發(fā)現(xiàn)缺乏病患者采取防治措施具有重要意義。

GR催化NADPH還原G SSG，生成GSH，GSH與5，5’-二硫代-雙-（2-硝 基苯甲酸）（5，5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反應產(chǎn)生2-硝基-5-*甲酸，2-硝基-5-*甲酸在波長412nm處有特征吸收峰，通過412nm處吸光度的變化可計算GR的活性。根據(jù)加入FAD前后GR活性的變化可計算得到GRAC。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、分析天平、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：具體的操作步驟請見“產(chǎn)品資料"文件

注意事項：

1. 建議準備核黃素水平正常的樣本進行檢測，方便與核黃素缺乏的樣本進行比較；如果沒有核黃素水平正常的樣本，可參考一般核黃素水平正常的樣本GRAC為0.9-1.2；

2. 如果樣本測定管吸光值大于1.5，建議將樣本用試劑一稀釋后進行測定；如果樣本測定管吸光值接近空白管，可適當增大樣本質(zhì)量重新提取或提高加樣表中樣本體積，對照管、空白管蒸餾水需進行相應調(diào)整。

3. 樣本蛋白濃度需自行測定。由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約0.11mg/mL），所以在測定樣本蛋白濃度時需要減去提取液本身的蛋白含量。

實驗實例：

1. 取0.1051g大鼠腎臟樣本，加入1mL試劑一進行冰浴勻漿，離心后取上清，按照測定步驟操作，用96孔板測得：A測定=0.370，A對照=0.360，A空白=0.107，計算得：

GRAC=（A測定-A空白）÷（A對照-A空白）= 1.040。

2. 取10μL人紅細胞，加入990μL試劑一，充分溶血混勻，離心后取上清，按照測定步驟操作，用96孔板測得：A測定=0.479，A對照=0.461，A空白=0.107，計算得：

GRAC=（A測定-A空白）÷（A對照-A空白）= 1.051。

3. 取馬血清樣本，直接按照測定步驟操作，用96孔板測得：A測定=0.397，A對照=0.392，A空白=0.107，計算得：

GRAC=（A測定-A空白）÷（A對照-A空白）= 1.018。

參考文獻：

[1] Sauberlich H E, Judd J H, Nichoalds G E, et al. Application of the erythrocyte glutathione reductase assay in evaluating riboflavin nutritional status in a high school student population [J]. The American Journal of Clinical Nutrition, 1972, 25(8): 756-762.

[2] Gu CF, Chen YZ, Wang ZY. A study of the activation coefficients of blood glutathione reductase in the evaluation of experimental riboflavin deficiency [J]. Acta Nutrimenta Sinica, 1981, 3(4): 251-260.

[3] Ono S, Hirano H. FAD-induced in vitro activation of glutathione reductase in the lens of B2 deficient rats [J]. Current eye research, 1984, 3(4): 663-665.

[4] He J, Hu ML, H YM, et al. Study on the optimum conditions for determination of glutathione reductase activity coefficient in whole blood [J]. Chinese Journal of Public Health, 2002, 18(5): 615-616.

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