蔗糖磷酸化酶（SP）活性檢測(cè)試劑盒說明書微量法

貨號(hào)：BC0455

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前加入6 mL蒸餾水，充分混勻。2-8℃可以保存4周。

2、 試劑四：臨用前取1支加入0.6 mL蒸餾水，充分混勻。分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融，可以保存2周；

3、 試劑五：粉劑置于瓶?jī)?nèi)玻璃管中。臨用前加入10 mL蒸餾水，充分混勻。-20℃分裝保存，避免反復(fù)凍融，可以保存4周；

4、 試劑六：臨用前取1支加入1 mL蒸餾水，充分混勻（可做100T，為保證試劑盒使用時(shí)間，故多給一支）；可分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融，-20℃可以保存2周；臨用前按試劑六：蒸餾水=1:1的比例稀釋試劑六，現(xiàn)用現(xiàn)配；

5、 試劑七：臨用前取1支加入0.7 mL蒸餾水，充分混勻；可分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融，-20℃可以保存2周；臨用前按試劑七：蒸餾水=1:1的比例稀釋試劑七，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

蔗糖磷酸化酶（Sucrose Phosphorylase, SP）(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中，屬于糖基水解酶13家族，是一種催化轉(zhuǎn)移葡萄糖苷鍵的酶，能夠催化蔗糖和無機(jī)磷酸鹽合成1-磷酸-葡萄糖。該酶主要以蔗糖、1-磷酸葡萄糖為供體，多類物質(zhì)如多羥基的糖和糖醇、酚羥基、羧基等為受體，催化合成各種糖苷。

SP能夠催化蔗糖產(chǎn)生1-磷酸葡萄糖，在葡萄糖磷酸變位酶催化下變位為6-磷酸葡萄糖，在6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下還原NADP⁺生成NADPH，導(dǎo)致340nm光吸收值增加。通過340nm吸光度的增加速率來反映SP活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱/水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽/勻漿器、微量石英比色皿/96孔UV板、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）︰提取液體積(mL)為1︰5-10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃，離心10min ，取上清置于冰上待測(cè)。

2、細(xì)胞或細(xì)菌：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500-1000︰1的比例（建議500萬個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌加入1 mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞或細(xì)菌（功率200 W，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3 min）；然后10000 g，4℃，離心10 min ，取上清置于冰上待測(cè)。

3、液體：直接檢測(cè)。若液體渾濁可離心后取上清測(cè)定。

二、測(cè)定步驟

1、 紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340 nm，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2、 試劑一37℃預(yù)熱10min。

3、 操作表：

二、SP活性計(jì)算：

1、 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式：

(1) 按照蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：37℃，每毫克蛋白質(zhì)每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH為一個(gè)酶活單位。

SP活性（U/mg prot）=ΔA÷ε÷d×V反總×10⁹÷（V樣×Cpr）÷T = 803.85×ΔA÷Cpr

(2) 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：37℃，每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH為一個(gè)酶活單位。

SP活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷ε÷d×V反總×10⁹÷(V樣÷V樣總×W)÷T= 803.85×ΔA÷W

(3) 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：37℃，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH為一個(gè)酶活單位。

SP活性（U/10⁴ cell）= ΔA÷ε÷d×V反總×10 ⁹÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)）)÷T

= 803.85×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)）

ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6220 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.0002L；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；V樣總：提取液體積，1mL ；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；10⁹：1mol=10⁹nmol。

2、 用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式：

將上述公式中的d-1cm修改為d-0.6cm（96孔板光徑）進(jìn)行計(jì)算即可。

注意事項(xiàng)：

1、如果測(cè)定吸光值A(chǔ)＞1，建議用提取液稀釋樣本后再測(cè)定，計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)；如果測(cè)定吸光值較低或接近空白OD值，建議增加樣本量后再進(jìn)行測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 稱取0.1 g土豆，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，10000 g，4℃條件下離心10 min；取上清置于冰上待測(cè)。使用微量石英比色皿按照測(cè)定步驟操作，計(jì)算ΔA=（0.4070-0.3117）-（0.0956-0.0949）=0.0946。計(jì)算活性：

蔗糖磷酸化酶酶活（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷ε÷d×V反總×10 ⁹÷(V樣÷V樣總×W)÷T =760.44 U/ g質(zhì)量

2、 稱取0.1 g黑米，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，10000 g，4℃條件下離心10 min；取上清置于冰上待測(cè)。使用微量石英比色皿按照測(cè)定步驟操作，計(jì)算ΔA =（0.4559-0.3546）-（0.0956-0.0949）=0.1006，計(jì)算活性：

蔗糖磷酸化酶酶活（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷ε÷d×V反總×10 ⁹÷(V樣÷V樣總×W)÷T =808.67 U/ g質(zhì)量

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