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        • 丙酮酸羧化酶(PC)活性檢測試劑盒 微量法
        產(chǎn)品名稱:

        丙酮酸羧化酶(PC)活性檢測試劑盒 微量法

        產(chǎn)品品牌: SOLARBIO/索萊寶 價(jià)格:
        廠商性質(zhì): 生產(chǎn)廠家 產(chǎn)品時(shí)間: 2024-04-16
        儲(chǔ)存條件
        -20℃
        丙酮酸羧化酶(PC)活性檢測試劑盒 微量法
        有效期
        6個(gè)月
        單位

        推薦
        若使用96孔板測定,需使用96孔UV板,推薦貨號YA0602
        英文名稱
        Pyruvate Carboxylase(PC) Activity Assay Kit
        別名
        丙酮酸羧化酶試劑盒 PC Kit 丙酮酸羧化酶(PC)試劑盒 丙酮酸羧化酶(PC)測試盒
        檢測方法
        微量法

        產(chǎn)品概述

        品牌SOLARBIO/索萊寶CAS詳詢
        分子式詳詢純度詳詢
        分子量詳詢貨號BC0735
        規(guī)格100T/96S供貨周期現(xiàn)貨
        主要用途丙酮酸羧化酶(PC)活性檢測應(yīng)用領(lǐng)域環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,綜合

        丙酮酸羧化酶(PC)活性檢測試劑盒說明書

        微量法

        注意:本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng),請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

        貨號: BC0735

        規(guī)格: 100T/96S

        產(chǎn)品組成:使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,有疑問請及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

        試劑名稱

        規(guī)格

        保存條件

        提取液

        液體110 mL×2

        2-8℃保存

        試劑一

        液體15 mL×1

        2-8℃保存

        試劑二

        液體5 mL×1

        2-8℃保存

        試劑三

        粉劑×1

        -20℃保存

        試劑四

        粉劑×1

        -20℃保存

        試劑五

        液體2 mL×1

        2-8℃保存

        試劑六

        粉劑×1

        -20℃保存

        試劑六稀釋液

        液體5 mL×1

        2-8℃保存

        溶液的配制:

        1、 試劑三:臨用前加入3 mL蒸餾水溶解;可分裝后-20保存2,避免反復(fù)凍融;

        2、 試劑四:臨用前加入2 mL蒸餾水溶解;可分裝后-20保存2周,避免反復(fù)凍融;

        3、 試劑六:臨用前加入0.13mL試劑六稀釋液溶解,可分裝后-20保存4周,避免反復(fù)凍融;

        4、 試劑六工作液:臨用前根據(jù)樣本量按試劑六:試劑六稀釋液=0.01mL0.3mL(共0.31mL,約15T)的比例進(jìn)行配制,現(xiàn)用現(xiàn)配,當(dāng)天用完;

        5、 工作液的配制:按照試劑二:試劑三:試劑四=2:1:1的體積比例充分混勻,現(xiàn)用現(xiàn)配。

        產(chǎn)品說明:

        丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PC,EC 6.4.1.1)廣泛存在于動(dòng)物、霉菌和酵母的線粒體中,但在植物體和大部分細(xì)菌中卻不含此酶。是供給草酰乙酸的主要補(bǔ)充反應(yīng),是糖異生過程的第一個(gè)限速酶。

        PC不可逆的催化丙酮酸、ATPCO2和水生成草酰乙酸、ADPPi,蘋果酸脫氫酶進(jìn)一步催化草酰乙酸和 NADH生成蘋果酸和NAD+,在340nm下測定NADH氧化速率,即可反映PC活性。

        注意:實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

        需自備的儀器用品:

        紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、微量石英比色皿/96UV板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

        操作步驟;

        一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn))

         

        1、 取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞,加入1.0 mL提取液,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

        2、 4℃1000g離心10min。將上清液移至另一離心管中,4℃11000g離心15min。

        3、 上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的PC(此步可選做,可以判斷線粒體提取效果)。

        4、 在沉淀中加入1mL提取液,超聲波破碎(功率200W,超聲5秒,間隔10秒,重復(fù)12次),用于PC活性測定,并且用于蛋白含量測定。

        二、測定步驟

        1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。

        2、 試劑一用前37孵育15min

        3、 操作表:

        試劑名稱(µL

        空白管

        測定管

        試劑一

        90

        90

        工作液

        64

        64

        試劑五

        16

        16

        試劑六工作液

        20

        20

        樣本

        -

        10

        蒸餾水

        10

        -

        在微量石英比色皿/96UV板中分別加入上述試劑,充分混勻后于340nm處測定10s時(shí)的吸光值A1,迅速置于37水浴或培養(yǎng)箱2min(酶標(biāo)儀有控溫功能可將溫度調(diào)至37),拿出迅速擦干測定130s時(shí)的吸光值A2,計(jì)算ΔA測定管=A1測定-A2測定,ΔA空白管=A1空白-A2空白,ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管。(空白管只需做1-2次)

        三、PC酶活計(jì)算

        1. 按微量石英比色皿計(jì)算:

        單位的定義:每毫克蛋白每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

        PC酶活(U/mg prot= ΔA÷ε×d×109×V反總÷V×Cpr÷T= 1607×ΔA÷Cpr

        εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4L;V樣:反應(yīng)體系中樣本體積,0.01mLCpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;T:反應(yīng)時(shí)間:2min。

        2. 96UV板計(jì)算:

        將上述計(jì)算公式中的d-1cm改為d-0.6cm進(jìn)行計(jì)算即可。

        注意事項(xiàng):

        1. 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,需先取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn),ΔA大于0.8時(shí)(96UV板測定時(shí)ΔA大于0.5時(shí)),建議將粗酶液用提取液稀釋后再進(jìn)行測定。當(dāng)ΔA小于0.01時(shí),可以延長反應(yīng)時(shí)間(5min10min)來測定。

        2. 空白管為檢測各試劑組分質(zhì)量的檢測孔,正常情況下,變化不超過0.05

        3. 樣本的蛋白濃度需自行測定,由于提取液中含有較高的蛋白濃度(約1mg/mL),所以測定樣本蛋白濃度時(shí)需扣除提取液自身蛋白濃度。

        4. 推薦使用樣本蛋白濃度計(jì)算酶活,若用樣本質(zhì)量計(jì)算,則需加測胞漿提取物酶活,上清和沉淀酶活之和方為總酶活。

        5. 本試劑盒試劑足夠完成100管反應(yīng)。

        6. :使用樣本重量計(jì)算公式:(樣本檢測數(shù)為100T/48S

        1)按微量石英比色皿計(jì)算:

        A、上清中PC活力的計(jì)算:

        按樣本質(zhì)量計(jì)算:

        酶活定義:每克樣本每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。

        PC酶活(U/g質(zhì)量)=ΔA1÷ε×d×109×V反總÷V×W÷V樣總)÷T = 1607×ΔA1÷W

        ΔA1:上清測定值;εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L/mol/cmd:比色皿光徑,1cm;V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4L;V樣:反應(yīng)體系中樣本體積,0.01mL;V提取:加入的提取液體積,1mLT:反應(yīng)時(shí)間:2min;W:樣本質(zhì)量,g。

        B、沉淀中PC活力的計(jì)算:

        按樣本質(zhì)量計(jì)算:

        酶活定義:每克樣本每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。

        PC酶活(U/g質(zhì)量)=ΔA2÷ε×d×109×V反總÷V×W÷V樣總)÷T = 1607×ΔA2÷W

        ΔA2:上清測定值;εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L/mol/cmd:比色皿光徑,1cm;V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4L;V樣:反應(yīng)體系中樣本體積,0.01mL;V提取:沉淀重懸體積,1mLT:反應(yīng)時(shí)間:2min;W:樣本質(zhì)量,g。

        C、樣本PC總活力的計(jì)算:

        樣本PC總活力即為上清中PC活力與沉淀中PC活力之和。

        按樣本質(zhì)量計(jì)算:

        PCU/g 質(zhì)量)=1607×ΔA1÷W+1607×ΔA2÷W。

        2)按96UV板計(jì)算:

        將上述計(jì)算公式中的d-1cm改為d-0.6cm進(jìn)行計(jì)算即可。

        實(shí)驗(yàn)實(shí)例

        1、 0.1g兔心組織加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨,用提取液稀釋上清100倍,稀釋沉淀4倍,之后按照測定步驟操作,用微量石英比色皿測得計(jì)算上清中的ΔA測定管=A1測定-A2測定=1.0091-0.7487=0.2604,ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.9948-0.9678=0.027,ΔA1=ΔA測定管-ΔA空白管=0.2604-0.027=0.2334,沉淀中的ΔA測定管=A1測定-A2測定=1.08-0.6157=0.4643,ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.9948-0.9678=0.027,ΔA2=ΔA測定管-ΔA空白管=0.4643-0.027=0.4373,按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得:

        上清:PC的酶活(U/g 質(zhì)量)= 1607×ΔA1÷W×100(稀釋倍數(shù))=1607×0.2334÷0.1×100=375073.8 U/g 質(zhì)量;

        沉淀:PC的酶活(U/g 質(zhì)量)=1607×ΔA2÷W×4(稀釋倍數(shù))=1607×0.4373÷0.1×4=28109.64 U/g 質(zhì)量;

        PC總酶活(U/g 質(zhì)量)=1607×ΔA1÷W×100(稀釋倍數(shù))+1607×ΔA2÷W

        =1607×0.2334÷0.1×100+1607×0.4373÷0.1×4=403183.44 U/g 質(zhì)量。

        相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn):

        [1] Esmail S. Kakey,Amez A. Ismael. Evaluation of Oxidative Stress Status in Aged Human in relation to some Diseases. International Conference on Pure and Applied Sciences. August 2018;

        相關(guān)系列產(chǎn)品:

        BC0920/BC0925 果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)活性檢測試劑盒

        BC3320/BC3325 葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)活性檢測試劑盒

        BC3310/BC3315 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)活性檢測試劑盒

        丙酮酸羧化酶(PC)活性檢測試劑盒 微量法 丙酮酸羧化酶(PC)活性檢測試劑盒 微量法

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