丙酮酸羧化酶（PC）活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號: BC0735

規(guī)格: 100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑三：臨用前加入3 mL蒸餾水溶解；可分裝后-20℃保存2周，避免反復(fù)凍融；

2、 試劑四：臨用前加入2 mL蒸餾水溶解；可分裝后-20℃保存2周，避免反復(fù)凍融；

3、 試劑六：臨用前加入0.13mL試劑六稀釋液溶解，可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融；

4、 試劑六工作液：臨用前根據(jù)樣本量按試劑六：試劑六稀釋液=0.01mL：0.3mL（共0.31mL，約15T）的比例進(jìn)行配制，現(xiàn)用現(xiàn)配，當(dāng)天用完；

5、 工作液的配制：按照試劑二：試劑三：試劑四=2:1:1的體積比例充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)廣泛存在于動(dòng)物、霉菌和酵母的線粒體中，但在植物體和大部分細(xì)菌中卻不含此酶。是供給草酰乙酸的主要補(bǔ)充反應(yīng)，是糖異生過程的第一個(gè)限速酶。

PC不可逆的催化丙酮酸、ATP、CO₂和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，蘋果酸脫氫酶進(jìn)一步催化草酰乙酸和 NADH生成蘋果酸和NAD⁺，在340nm下測定NADH氧化速率，即可反映PC活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、微量石英比色皿/96孔UV板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟;

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、 取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞，加入1.0 mL提取液，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、 4℃1000g離心10min。將上清液移至另一離心管中，4℃11000g離心15min。

3、 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的PC（此步可選做，可以判斷線粒體提取效果）。

4、 在沉淀中加入1mL提取液，超聲波破碎（功率200W，超聲5秒，間隔10秒，重復(fù)12次），用于PC活性測定，并且用于蛋白含量測定。

二、測定步驟

1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 試劑一用前37℃孵育15min。

3、 操作表：

三、PC酶活計(jì)算

1. 按微量石英比色皿計(jì)算：

單位的定義：每毫克蛋白每分鐘消耗1 nmol 的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PC酶活（U/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 1607×ΔA÷Cpr

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；T：反應(yīng)時(shí)間：2min。

2. 按96孔UV板計(jì)算：

將上述計(jì)算公式中的d-1cm改為d-0.6cm進(jìn)行計(jì)算即可。

注意事項(xiàng)：

1. 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需先取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，ΔA大于0.8時(shí)（96孔UV板測定時(shí)ΔA大于0.5時(shí)），建議將粗酶液用提取液稀釋后再進(jìn)行測定。當(dāng)ΔA小于0.01時(shí)，可以延長反應(yīng)時(shí)間（5min或10min）來測定。

2. 空白管為檢測各試劑組分質(zhì)量的檢測孔，正常情況下，變化不超過0.05。

3. 樣本的蛋白濃度需自行測定，由于提取液中含有較高的蛋白濃度（約1mg/mL），所以測定樣本蛋白濃度時(shí)需扣除提取液自身蛋白濃度。

4. 推薦使用樣本蛋白濃度計(jì)算酶活，若用樣本質(zhì)量計(jì)算，則需加測胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。

5. 本試劑盒試劑足夠完成100管反應(yīng)。

6. 附:使用樣本重量計(jì)算公式：（樣本檢測數(shù)為100T/48S）

（1）按微量石英比色皿計(jì)算：

A、上清中PC活力的計(jì)算:

按樣本質(zhì)量計(jì)算：

酶活定義：每克樣本每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PC酶活（U/g質(zhì)量）=ΔA1÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T = 1607×ΔA1÷W

ΔA1：上清測定值；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；V提取：加入的提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間：2min；W：樣本質(zhì)量，g。

B、沉淀中PC活力的計(jì)算:

按樣本質(zhì)量計(jì)算：

酶活定義：每克樣本每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PC酶活（U/g質(zhì)量）=ΔA2÷（ε×d）×109×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T = 1607×ΔA2÷W

ΔA2：上清測定值；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；V提取：沉淀重懸體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間：2min；W：樣本質(zhì)量，g。

C、樣本PC總活力的計(jì)算:

樣本PC總活力即為上清中PC活力與沉淀中PC活力之和。

按樣本質(zhì)量計(jì)算：

PC（U/g 質(zhì)量）=1607×ΔA1÷W+1607×ΔA2÷W。

（2）按96孔UV板計(jì)算：

將上述計(jì)算公式中的d-1cm改為d-0.6cm進(jìn)行計(jì)算即可。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例

1、 取0.1g兔心組織加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，用提取液稀釋上清100倍，稀釋沉淀4倍，之后按照測定步驟操作，用微量石英比色皿測得計(jì)算上清中的ΔA測定管=A1測定-A2測定=1.0091-0.7487=0.2604，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.9948-0.9678=0.027，ΔA1=ΔA測定管-ΔA空白管=0.2604-0.027=0.2334，沉淀中的ΔA測定管=A1測定-A2測定=1.08-0.6157=0.4643，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.9948-0.9678=0.027，ΔA2=ΔA測定管-ΔA空白管=0.4643-0.027=0.4373，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

上清：PC的酶活（U/g 質(zhì)量）= 1607×ΔA1÷W×100(稀釋倍數(shù))=1607×0.2334÷0.1×100=375073.8 U/g 質(zhì)量；

沉淀：PC的酶活（U/g 質(zhì)量)=1607×ΔA2÷W×4(稀釋倍數(shù))=1607×0.4373÷0.1×4=28109.64 U/g 質(zhì)量；

PC總酶活（U/g 質(zhì)量）=1607×ΔA1÷W×100(稀釋倍數(shù))+1607×ΔA2÷W

=1607×0.2334÷0.1×100+1607×0.4373÷0.1×4=403183.44 U/g 質(zhì)量。

相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)：

[1] Esmail S. Kakey,Amez A. Ismael. Evaluation of Oxidative Stress Status in Aged Human in relation to some Diseases. International Conference on Pure and Applied Sciences. August 2018;

相關(guān)系列產(chǎn)品：

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