細胞壁結(jié)合酸性轉(zhuǎn)化酶（CWI）活性檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

貨號：BC4320

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前加入25 mL試劑一，充分溶解后待用；

2、 標(biāo)準(zhǔn)品：10 mg無水*萄糖。臨用前加入1 mL 蒸餾水充分溶解，配成10 mg/mL葡萄糖溶液備用，2-8℃保存一周。

產(chǎn)品說明：

蔗糖轉(zhuǎn)化酶（Invertase，Inv）不可逆的催化蔗糖裂解形成葡萄糖和果糖，在植物蔗糖代謝中發(fā)揮著重要作用。Inv根據(jù)最適pH，可分為酸性轉(zhuǎn)化酶（AI）和中性轉(zhuǎn)化酶（NI），其中AI根據(jù)亞細胞定位的差異又可分為可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶（Soluble acid Invertase，SAI）和細胞壁結(jié)合酸性轉(zhuǎn)化酶（Cell wall-bound acid Invertase，CWI）。 CWI以離子鍵的形式結(jié)合在細胞壁上，在“庫"組織韌皮部蔗糖卸載、蔗糖質(zhì)外運輸、植物的生長發(fā)育以及抵抗各種脅迫中起著重要作用。

CWI催化蔗糖降解產(chǎn)生還原糖，還原糖與3,5 –二硝基水楊酸反應(yīng)生成在540nm有特征吸收峰的棕紅色物質(zhì)，通過測定540nm處吸光值變化可計算得CWI活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、臺式低溫離心機、水浴鍋、1mL玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

組織：按照質(zhì)量（g）: 提取液一體積（mL）為1 : 5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，12000g，離心10min，棄上清，留沉淀；沉淀中加入1mL蒸餾水，充分震蕩混勻，4℃，12000g，離心10min，棄上清，留沉淀；沉淀中加入1mL提取液二，充分混勻，4℃浸提15 h，4℃，12000g，離心10min，取上清置于冰上待測。

二、測定步驟

1、 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至540nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 將10mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為1、0.8、0.6、0.5、0.4、0.3mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

3、 操作表 (在2mL離心管中操作) ：

注意：如果樣本在37℃反應(yīng)后的95℃水浴步驟中出現(xiàn)沉淀，建議室溫12000g，離心5min，取上清（若上清不足1000µL，可按比例縮小加樣體系，如800µL上清+400µL試劑三）進行下一步操作。

三、CWI活性計算

1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

以各個標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為x軸，其對應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y=kx+b，將ΔA帶入方程得到x（mg/mL）。

2、 CWI活性的計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算

酶活定義：37℃每mg蛋白每分鐘分解蔗糖產(chǎn)生1µg還原糖為1個酶活力單位。

CWI酶活（U/mg prot）= x×V提取÷（V提取×Cpr）×10³÷T = 33.33x÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：37℃每g樣本每分鐘分解蔗糖產(chǎn)生1µg還原糖為1個酶活力單位。

CWI酶活（U/g質(zhì)量）= x×V提取×10³÷W÷T = 33.33x÷W

V提取：提取液體積，1mL；10³：單位換算系數(shù)，1mg=10³µg；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，30min。

注意事項：

1. 當(dāng)A或ΔA超過1時，建議將樣本用提取液二稀釋后再進行測定，計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

2. 95℃水浴時EP管蓋緊，防止水分散失，待冷卻至室溫后（建議每次實驗后冷卻時間保持一致），再進行下一步操作，避免液體飛濺燙傷以及影響試驗數(shù)據(jù)。

實驗實例：

1. 取0.1g丁香葉加入1mL提取液進行勻漿研磨，最后取上清后按照操作步驟操作，測A對照管=0.566，A測定管=0.903，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.315x-0.2723，A空白管=0.058，計算ΔA=A測定管-A對照管=0.903-0.566=0.337，x=（0.337+0.2723）÷1.315=0.463，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

CWI酶活（U/g質(zhì)量）= 33.33x÷W= 33.33×0.463÷0.1=154.433 U/g質(zhì)量。

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