亞鐵氧化酶（HP）活性檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

貨號：BC4340

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、試劑三：臨用前加入7 mL蒸餾水溶解備用，用不完的試劑2-8℃保存4周。

2、標(biāo)準(zhǔn)品：9 µmol/mL的亞鐵離子標(biāo)準(zhǔn)液。

產(chǎn)品說明：

亞鐵氧化酶（Hsphasetin，HP）是銅藍(lán)蛋白的同系物，催化亞鐵離子（Fe²⁺）氧化為三價鐵離子（Fe³⁺），從而三價鐵與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合，參與細(xì)胞鐵釋放。

以一定濃度的Fe²⁺ 為底物，在亞鐵氧化酶的催化作用下Fe²⁺ 被氧化為Fe³⁺，Fe²⁺ 與菲咯嗪形成有色復(fù)合物，在562 nm處有特征吸收峰，先計(jì)算出未被氧化的Fe²⁺ 的含量，進(jìn)而得出被氧化的Fe²⁺ 的含量，可通過Fe²⁺ 被氧化的速率來反映亞鐵氧化酶活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、1 mL玻璃比色皿、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水、EP管。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織：按照質(zhì)量（g）︰蒸餾水體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1 g，加入1 mL蒸餾水）加入蒸餾水，冰浴勻漿后于10000 rpm，4℃離心10 min，取上清置于冰上待測。

2、血清或血漿：建議用蒸餾水將血清或血漿稀釋2~4倍后直接檢測。若溶液渾濁則離心取上清置于冰上待測。

二、測定步驟

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至562 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋：將9 µmol/mL的亞鐵離子標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水倍比稀釋為360、180、90、45、22.5、11.25、5.625 nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

3、 標(biāo)準(zhǔn)液稀釋可參考下表：

備注：實(shí)驗(yàn)中每個標(biāo)準(zhǔn)管需100µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

4、 操作表：在1.5 mL離心管中依次加入下列試劑：

三、亞鐵氧化酶活性計(jì)算

1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

以各個標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（nmol/mL）為x軸，其對應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y= kx+b，將ΔA測定帶入方程得到樣本濃度（x，nmol/mL）。

2、 亞鐵氧化酶活性的計(jì)算：

（1）按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：每mg蛋白每分鐘氧化1 nmol的Fe²⁺ 定義為1個酶活力單位。

亞鐵氧化酶酶活（U/mg prot）= x×V試劑二÷（V樣×Cpr）÷T ×N= 1.667x÷Cpr×N

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：每g樣品每分鐘氧化1 nmol的Fe²⁺ 定義為1個酶活力單位。

亞鐵氧化酶酶活（U/g質(zhì)量）= x×V試劑二÷（V樣×W÷V提取）÷T×N = 1.667x÷W×N

（3）按液體體積計(jì)算

酶活定義：每mL樣本每分鐘氧化1 nmol的Fe²⁺ 定義為1個酶活力單位。

亞鐵氧化酶酶活（U/mL）= x×V試劑二÷V樣÷T ×N= 1.667x×N

V試劑二：加入的試劑二體積，0.1 mL；V樣：加入的樣本體積，0.02 mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間：3 min；N：稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1、當(dāng)A測定低于0.1時，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測定，計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1g脾臟，進(jìn)行樣本處理，按照測定操作步驟，測得計(jì)算ΔA測定=（A無基質(zhì)管-A空白管）-（A測定管-A對照管）=（0.976-0.005）-（0.996-0.047）=0.022，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 0.0027x + 0.0036，計(jì)算x=6.815，按照樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

亞鐵氧化酶酶活（U/g質(zhì)量）= 1.667×x÷W×N= 1.667×6.815÷0.1=113.603 U/g質(zhì)量。

2、 取兔血清，按照測定操作步驟，測得計(jì)算ΔA測定=（A無基質(zhì)管-A空白管）-（A測定管-A對照管）=（0.976-0.005）-（0.469-0.009）=0.511，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 0.0027x + 0.0036，計(jì)算x=187.926，按照液體體積計(jì)算酶活得：

亞鐵氧化酶酶活（U/mL）= 1.667×x=1.667×187.926=313.273 U/mL。

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