尿酸酶活性檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC4430

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制： 

1、 標準品：臨用前加入898 µL蒸餾水得到1 mmol/mL的過氧*氫溶液，2-8℃保存4周。

2、 工作液A的配制：按照試劑二：試劑三：試劑四 = 0.85mL：2.55mL：1.7mL（共5.1mL，6S）的比例配制，用于樣本測定管、空白管及標準管的檢測。根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用，配后建議2小時內用完（2-8℃或者冰上保存）。

3、 工作液B的配制：按照試劑二：試劑三：試劑一 = 0.85mL：2.55mL：1.7mL（共5.1mL，6S）的比例配制，用于樣本對照管的檢測。根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用，配后建議2小時內用完（2-8℃或者冰上保存）。

產(chǎn)品說明：

尿酸酶，又名尿酸*化酶，是一種參與嘌呤降解途徑的氧化酶，可以將尿酸分解為尿囊酸素進而排出體外。尿酸為嘌呤代謝的終末產(chǎn)物，積累過多將導致痛風、腎病、心血管疾病等多種疾病的發(fā)生。尿酸酶在尿酸相關疾病的臨床檢測以及治療中有著重要意義。

尿酸酶催化尿酸分解為尿*素、CO₂和H₂O₂，H₂O₂氧化亞鐵*中的Fe²⁺生成Fe³⁺，Fe³⁺進一步與4-氨基安*比林和酚反應生成紅色醌類化合物，在505 nm處有特征吸收峰，通過測定505 nm處的吸光值來反映尿酸酶的活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、1 mL玻璃比色皿、可調式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超

聲破碎儀、冰、EP管、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

組織：按照組織質量（g）: 提取液體積（mL）為1 : 5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液）進行冰浴勻漿，然后10000 rpm，4℃，離心10 min，取上清置于冰上待測。

細菌或細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）: 提取液體積（mL）為500~1000 : 1的比例（建議500萬個細菌或細胞加入1 mL提取液），冰浴超聲波破碎細菌或細胞（功率200 W，超聲3 s，間隔7 s，總時間5 min）；然后10000 rpm，4℃，離心10 min，取上清置于冰上待測。

二、測定步驟

1、 分光光度計預熱30 min以上，調節(jié)波長至505 nm，蒸餾水調零。

2、 將1 mmol/mL 標準液用蒸餾水稀釋為0.25 µmol/mL的標準溶液備用。標準溶液的稀釋：取20μL 1mmol/mL過氧化氫標準液，加入1980μL蒸餾水，充分混勻，配制成10μmol/mL標準液，再取50μL 10μmol/mL過氧化氫標準液，加入1950μL蒸餾水，充分混勻，配制成0.25μmol/mL標準液使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。（實驗中每管需要150μL，為減小實驗誤差，故配制大體積）。

3、 操作表：(在1.5 mL離心管中)

三、尿酸酶活性計算

（1）按樣本質量計算

酶活定義：在pH 8.8的條件下，每克樣本每小時分解尿酸產(chǎn)生 1 μmol 的H₂O₂定義為一個酶活力單位。

尿酸酶酶活（U/g 質量）= ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V樣本÷（W×V樣本÷V提取）÷T

= 0.5×ΔA測定÷ΔA標準÷W

（2）按蛋白濃度計算

酶活定義：在pH 8.8的條件下，每毫克蛋白每小時分解尿酸產(chǎn)生 1 μmol 的H₂O₂定義為一個酶活力單位。

尿酸酶酶活（U/mg prot）= ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V樣本÷（Cpr×V樣本）÷T

= 0.5×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr

（3）按照細菌或細胞數(shù)量計算

酶活定義：在pH8.8的條件下，每10⁴個細菌或細胞每小時分解尿酸產(chǎn)生 1 μmol 的H₂O₂定義為一個酶活力單位。

尿酸酶酶活（U/10⁴ cell）= ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V樣本÷（N×V樣本÷V提?。?/span>÷T

=0.5×ΔA測定÷ΔA標準÷N

C標準：標準溶液濃度，0.25 µmol/mL；V樣本：加入的樣本體積，0.15 mL；V提?。禾崛∫后w積，1 mL；T：酶促反應時間：0.5 h；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；N：細菌數(shù)量（以萬計）。

注意事項：

1、 A大于1時，建議將樣本用提取液稀釋后再進行測定，并在計算時乘以相應的稀釋倍數(shù)。

2、 工作液A與工作液B，需根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用，配后建議2小時內用完。工作液本身為淡黃色，隨著時間的延長，會變?yōu)榧t色，如有變色，則視為失效，需重新配制。

實驗實例：

1、 取0.1g小鼠肝臟進行樣本處理，取上清稀釋8倍后按測定步驟操作，測定計算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.652-0.218=0.434，ΔA標準=A標準管-A空白管=0.614-0.017=0.597，按樣本質量計算酶活得：尿酸酶酶活（U/g 質量）= 0.5×ΔA÷ΔA標準÷W×8（稀釋倍數(shù)）=29.08 U/g 質量。

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