葡萄糖含量檢測(cè)試劑盒(鄰甲苯胺顯色法)說(shuō)明書

微量法

貨號(hào)：BC5875

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：取3.6mL試劑二、18mL冰乙酸加入試劑一混合，最后工作液為均一澄清液體。溶解好的試劑-20℃分裝避光可以保存8周。（注：若先將試劑一、試劑二混合，則溶液為無(wú)機(jī)相和水相的液體混合物，加入冰乙酸混勻后溶液會(huì)變均一澄清）

2、 標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入1 mL 蒸餾水充分溶解，制備 10 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液待用；用不完的試劑2-8℃保存4周。臨用前取30μL10mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入930μL蒸餾水，配制成0.3125mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

產(chǎn)品說(shuō)明：

葡萄糖不僅是細(xì)胞能量代謝的主要底物，而且其代謝中間產(chǎn)物是生物合成的重要底物。植物可通過(guò)光合作用產(chǎn)生葡萄糖。就哺乳動(dòng)物而言，葡萄糖不僅是大腦神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉、脂肪組織等的唯*能源，而且與還原性輔酶、乳糖和乳脂的合成密切相關(guān)。

葡萄糖與鄰甲苯胺在強(qiáng)酸溶液中加熱，葡萄糖的醛基與鄰甲苯胺縮合成葡萄糖基胺，后者脫水生成席夫（Schiff）堿，呈現(xiàn)藍(lán)綠色，在630nm處有吸收峰。該試劑盒適合測(cè)定動(dòng)物組織、血清（漿）及細(xì)胞（細(xì)菌）樣本。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、分析天平、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、可調(diào)式移液槍、冰乙酸（98% AR）、5%三氯*酸（根據(jù)注意事項(xiàng)確定是否需要自備）、異丙醇（根據(jù)注意事項(xiàng)確定是否需要自備）、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 血清（漿）等液體樣本：直接測(cè)定。若液體有渾濁則離心取上清測(cè)定。

2. 動(dòng)物組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3. 細(xì)胞/細(xì)菌：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1．可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至630nm，可見分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2．操作表：（在1.5mL EP管中加入下列試劑）

三、葡萄糖含量計(jì)算

1. 按樣本質(zhì)量計(jì)算

葡萄糖含量（mg/mL）= ΔA測(cè)定×（C標(biāo)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)）×V提÷W = 0.3125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W

2. 按樣本蛋白濃度計(jì)算

葡萄糖含量（mg/mg prot）= ΔA測(cè)定×（C標(biāo)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)）×V樣÷(V樣×Cpr) =0.3125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr

3. 按液體體積計(jì)算

葡萄糖含量（mg/mL）= ΔA測(cè)定×（C標(biāo)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)）×V樣÷V樣= 0.3125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)

4. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

葡萄糖含量（mg/10⁴ cell）= ΔA測(cè)定×（C標(biāo)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)）×V提÷N= 0.3125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N

C標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.3125mg/mL；V提：前處理提取液體積，1mL；V樣：加入樣本體積，0.05mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；N：細(xì)胞數(shù)量，以萬(wàn)計(jì)。

注意事項(xiàng)：

1、 試劑一具有腐蝕性，請(qǐng)佩戴好手套口罩，小心操作。

2、 高血脂樣本若最終反應(yīng)液出現(xiàn)渾濁，在反應(yīng)液中加入550μL的異丙醇，充分混合，可以溶解脂質(zhì)，消除渾濁，測(cè)定其吸光值。計(jì)算時(shí)將所測(cè)得吸光度乘以1.5。

3、 嚴(yán)重黃疸、溶血等血清樣本，需要先制備無(wú)蛋白血濾液（建議100μL樣本加300μL 5%三氯*酸溶液，充分混合，相當(dāng)于將樣本稀釋四倍，3000rpm 4℃離心10min,取上清待測(cè)），再進(jìn)行計(jì)算。注意同步修改計(jì)算公式。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取50μL人血清樣本，用蒸餾水稀釋5倍，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算：ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A空白=0.450-0.057=0.393，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.708-0.057=0.651，按液體體積計(jì)算得：

葡萄糖含量（mg/mL）=0.3125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×5 =0.943mg/mL。

2. 取0.1g小鼠肌肉組織，按前處理和測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算：ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A空白=0.168-0.057= 0.111，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.708-0.057=0.651，按液體體積計(jì)算得：

葡萄糖含量（mg/mL）=0.3125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W =0.533mg/mL。

參考文獻(xiàn)：

[1] Yee H Y, Goodwin J F. Evaluation of some factors influencing the o-toluidine reaction with glucose[J]. Analytical Chemistry, 2002, 45(13).DOI:10.1021/ac60335a030.

[2] Dubowski K M. An o-Toluidine Method for Body-Fluid Glucose Determination[J]. Clinical Chemistry, 1962(6) :6.DOI:10.1093/clinchem/8.6.592.

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