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        • Caspase-5活性測定試劑盒 常量法
        產(chǎn)品名稱:

        Caspase-5活性測定試劑盒 常量法

        產(chǎn)品品牌: SOLARBIO/索萊寶 價格:
        廠商性質(zhì): 生產(chǎn)廠家 產(chǎn)品時間: 2024-04-24
        有效期
        6個月
        儲存條件
        -20℃
        中文名稱
        Caspase-5活性測定試劑盒 常量法
        單位

        英文名稱
        Caspase-5 Activity Assay Kit
        檢測方法
        比色法 Colorimetric
        規(guī)格
        50T ; 100T ; 20T

        產(chǎn)品概述

        品牌SOLARBIO/索萊寶CAS詳詢
        分子式詳詢純度詳詢
        分子量詳詢貨號BC3820
        規(guī)格20T 50T 100T供貨周期現(xiàn)貨
        主要用途Caspase-2活性測定應(yīng)用領(lǐng)域環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,綜合

        Caspase-5活性檢測試劑盒說明書

        比色法

        貨號BC3850

        規(guī)格:20T、50T、100T

        產(chǎn)品組成使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

        試劑名稱/規(guī)格  

        20T 

        50T

        100T

        保存條件

        試劑一

        液體20 mL×1

        液體20 mL×1

        液體25 mL×1

        -20℃保存

        試劑二

        液體30 mL×1

        液體60 mL×1

        液體120 mL×1

        -20℃保存

        試劑三

        液體0.25 mL×1

        液體0.55 mL×1

        液體0.55 mL×2

        -20℃保存

        標(biāo)準(zhǔn)品

        液體1mL×1

        液體1 mL×1

        液體1 mL×1

        -20℃保存

        溶液的配制:

        1、 試劑一:分裝-20℃保存。

        2、 試劑二:分裝-20℃保存。

        3、 標(biāo)準(zhǔn)品:pNA標(biāo)準(zhǔn)溶液,5 mmol/L。標(biāo)準(zhǔn)溶液在4℃條件下為渾濁狀態(tài),溶解即可變?yōu)槌吻鍫顟B(tài),不影響使用。

        4、 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液配制:取9 mL試劑一加入1 mL試劑二,充分混勻待用。(也可按照試劑一:試劑二=9:1的比例,自行配制)。

        產(chǎn)品說明:

        Caspase是參與細(xì)胞凋亡過程的蛋白酶家族,包含10多個成員。Caspase-5分子量47.7kD,與ICE51%的同源性,在過量表達(dá)時可誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。

        Caspase-5特異水解其多肽底物N-acetyl-Trp-Glu-His-Asp-p-nitroanilide (Ac-WEHD-pNA),釋放出游離的硝基苯胺pNA,后者呈黃色在405 nm具有最大吸收峰,采用可見光光度比色法進(jìn)行測定,吸光度值對應(yīng)于Caspase-5的水解活性。

        注意:實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

        需自備的儀器和用品:

        可見分光光度計/酶標(biāo)儀、100μL玻璃比色皿/96孔板、臺式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

        操作步驟:

        一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn))

        1、培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)胞數(shù)量(約106個)加100μL試劑二(若裂解不充分可提高至150-200 μL),震蕩重懸沉淀,置冰上靜置15 min4℃,15000g離心10-15min,取上清置冰上待測。

        2、組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑二體積(mL)為15~10的比例(建議稱取約0.1 g組織,加入1 mL試劑二),冰浴研磨或充分剪碎,置冰上靜置15 min,4℃15000g離心10-15min,取上清置冰上待測。

        二、測定步驟

        可見分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至405nm,蒸餾水調(diào)零。

        臨用前用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液5 mmol/L pNA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至200、100、50、25、12.5、0μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。

        樣本測定(96孔板/EP中按順序加入以下試劑)

        試劑名稱(μL

        測定管

        空白管

        標(biāo)準(zhǔn)管

        試劑一

        40

        40


        樣本

        50



        試劑二


        50


        試劑三

        10

        10


        標(biāo)準(zhǔn)溶液



        100

        混勻,蓋緊96孔板蓋子并用封口膜密封。37℃孵育60-120分鐘。發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯時即可測定405nm處吸光值。如果顏色變化不明顯,可以適當(dāng)延長孵育時間,甚至可以孵育過夜。空白管只需做1-2次。計算ΔA測定=A測定管-A空白管。

        立即測定405nm下吸光度

        三、Caspase-5活性計算

        1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:

        根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度(x,μmol/L)和ΔA標(biāo)準(zhǔn)y,減去濃度為0的空白管)做標(biāo)準(zhǔn)方程。將ΔA測定代入標(biāo)準(zhǔn)方程得到xμmol/L)。

        2. 按酶活性增加百分比計算

        Caspase-5活性增加百分比=(實(shí)驗(yàn)處理組A測定-A空白管)/(實(shí)驗(yàn)對照組A測定-A空白管)×100%

        該方法簡單可靠,可粗略反應(yīng)酶活性情況。

        按酶活計算

        參考Chemicon公司的caspase酶活力單位的定義:One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一個酶活力單位定義為當(dāng)?shù)孜镲柡蜁r,在37℃一個小時內(nèi)可以剪切1nmol pNA底物產(chǎn)生1nmol游離 pNA的酶量。這樣就可以計算出樣本中含有多少個酶活力單位的caspase酶活性。

        Caspase-5活性(U/mg prot=x×V反總÷V×Cpr÷T×103=2x÷Cpr÷T

        V反總:反應(yīng)體系總體積,0.1mL=10-4L;V樣:加入的樣本體積,0.05mLT:反應(yīng)時間,h;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;103:單位換算系數(shù),1μmol =103nmol。

        注意事項(xiàng):

        1、由于試劑中含有還原劑(DTT),建議將樣本用水稀釋2倍后,用Bradford法測定蛋白濃度,以降低DTT對蛋白濃度測定的干擾。不建議使用BCA法測定蛋白濃度。

        2、Caspase活性測定值低最常見的原因是細(xì)胞未發(fā)生凋亡或細(xì)胞量太少,其次是觀測時間不恰當(dāng)。誘導(dǎo)凋亡時,并非劑量越大時間越長Caspase活性就越高。建議設(shè)置不同劑量和時間點(diǎn)如02、4、8、16、24小時,以檢測最佳的觀察點(diǎn)。

        3、所測樣本的值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限,可用試劑二稀釋樣本后重新測定。

        4、蓋緊96孔板蓋子并用封口膜密封。37oC孵育,肉眼可見顏色變黃時的OD405值約為0.2,此時即可測定。顏色變化不明顯可延長反應(yīng)或過夜,但酶活性較強(qiáng)時,孵育時間過長將導(dǎo)致反應(yīng)失去線性關(guān)系。

        參考文獻(xiàn):

        [1] Cohen GM. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J, 1997, 326: 1-16.

        [2] Janicke R U, Sprengart M L, Wati M R, et al. Emerging role of caspase-3 in apoptosis[J]. Cell Death and Differentiation, 1999, 6:99-104.

        相關(guān)系列產(chǎn)品:

        BC3810  Caspase-1活性檢測試劑盒

        BC3820  Caspase-2活性檢測試劑盒

        BC3830  Caspase-3活性檢測試劑盒

        BC3840  Caspase-4活性檢測試劑盒

        BC3860  Caspase-6活性檢測試劑盒

        BC3880  Caspase-8活性檢測試劑盒

        BC3890  Caspase-9活性檢測試劑盒

        Caspase-5活性測定試劑盒 常量法 Caspase-5活性測定試劑盒 常量法

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