GU氨酸合成酶（GOGAT）活性檢測試劑盒說明書

紫外分光光度法

貨號：BC0070

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 工作液的配制：取試劑二、試劑三、試劑四各一支加入30 mL試劑一中溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配，可分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品說明：

GOGAT主要存在于原核生物、酵母菌及高等植物非綠色組織的前質(zhì)體中，和GU氨酰胺合成酶（GS）共同構(gòu)成GS/GOGAT循環(huán)，參與氨同化的調(diào)控。

GOGAT以NADH為電子供體，催化GU氨酰胺的氨基轉(zhuǎn)移到α-酮戊二酸形成兩分子的GU氨酸，NADH在340nm吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。  

二、測定步驟

1、 紫外分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 工作液提前配置，平衡至室溫。

3、 樣本測定

三、GOGAT活性計算

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

GOGAT活性（U/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=321.5×ΔA÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

GOGAT活性（U/g 質(zhì)量）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.5×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算：

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

GOGAT活性（U/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.643×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，10^-3L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，5min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol =10⁹nmol。

注意事項：

1、測定期間樣本在冰上放置，以免變性和失活。

2、最好兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3、當(dāng)A1大于1.5或者ΔA大于0.6時，建議將樣本用蒸餾水稀釋后測定，當(dāng)ΔA過小時，可以延長酶促反應(yīng)時間（10min或15min）或者加大加入的樣本體積進行測量。

4、由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測定樣品蛋白濃度時需要減去提取液本身的蛋白含量。

實驗實例：

1、 取0.1g紅豆芽加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清后按照測定步驟操作，測得計算ΔA= A1-A2=1.23-1.067=0.163，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

GOGAT活性（U/g 質(zhì)量）=321.5×ΔA÷W=321.5×0.163÷0.1=524 U/g 質(zhì)量。

2、 取0.1g稗草加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清后按照測定步驟操作，測得計算ΔA= A1-A2=1.416-1.404=0.012，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

GOGAT活性（U/g 質(zhì)量）=321.5×ΔA÷W=321.5×0.012÷0.1=38.58 U/g 質(zhì)量。

相關(guān)發(fā)表文獻：

[1] Fei Ding,Qiannan Hu,Meiling Wang,et al. Knockout of SlSBPASE Suppresses Carbon Assimilation and Alters Nitrogen Metabolism in Tomato Plants. International Journal of Molecular Sciences. December 2018;(IF4.183)

[2] Jie Wang,Wei Zhou,Hui Chen,et al. Ammonium Nitrogen Tolerant Chlorella Strain Screening and Its Damaging Effects on Photosynthesis. Frontier in Immunology. January 2019;(IF4.259)

[3] Meng L, Li W, Zhang S, et al. Effects of sucrose amendment on ammonia assimilation during sewage sludge composting[J]. Bioresource technology, 2016, 210: 160-166.

參考文獻：

[1] del Pilar Cordovilla M, Pérez J, Ligero F, et al. Partial purification and characterization of NADH-glutamate synthase from faba bean (Vicia faba) root nodules[J]. Plant science, 2000, 150(2): 121-128.

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