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        • 順烏頭酸酶活性檢測試劑盒 三羧酸
        產(chǎn)品名稱:

        順烏頭酸酶活性檢測試劑盒 三羧酸

        產(chǎn)品品牌: SOLARBIO/索萊寶 價格:
        廠商性質(zhì): 生產(chǎn)廠家 產(chǎn)品時間: 2024-04-16
        儲存條件
        -20℃
        中文名稱
        順烏頭酸酶活性檢測試劑盒 三羧酸
        有效期
        6個月
        單位

        英文名稱
        Aconitase(ACO)Activity Assay Kit
        檢測方法
        紫外分光光度法 Spectrophotometer
        規(guī)格
        50T/48S

        產(chǎn)品概述

        品牌SOLARBIO/索萊寶CAS詳詢
        分子式詳詢純度詳詢
        分子量詳詢貨號BC4480
        規(guī)格50T/48S供貨周期現(xiàn)貨
        主要用途順烏頭酸酶活性檢測應用領域環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,綜合

        順烏頭酸酶(ACO)活性檢測試劑盒說明書

        紫外分光光度法

        貨號BC4480

        規(guī)格50T/48S

        產(chǎn)品組成:使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

        試劑名稱

        規(guī)格

        保存條件

        試劑一

        液體80 mL×1

        2-8℃保存

        試劑二

        液體35 mL×1

        2-8℃保存

        試劑三

        液體0.6 mL×2

        -20℃保存

        試劑四

        液體50 mL×1

        2-8℃保存

        溶液的配制:

        1、試劑三:易揮發(fā)試劑,使用后盡快擰緊蓋子,密封后放入-20保存;

        產(chǎn)品說明:

        順烏頭酸酶(Aconitase, ACO)是細胞內(nèi)一種重要的鐵硫蛋白酶,主要存在于胞漿與線粒體中。ACO催化細胞內(nèi)檸檬酸經(jīng)中間產(chǎn)物順烏頭酸生成異檸檬酸的可逆反應,對維持三羧酸循環(huán)及乙醛酸循環(huán)的順利進行起著重要作用。

        順烏頭酸酶催化異檸檬酸生成順烏頭酸,順烏頭酸在240nm有特征吸收峰,通過檢測順烏頭酸的產(chǎn)生速率來計算該酶活性。

        注意:實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

        需自備的儀器和用品:

        紫外分光光度計、低溫臺式離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、超聲波細胞破碎儀、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

        操作步驟:

        一、順烏頭酸酶的提取(可適當調(diào)整待測樣本量,具體比例可以參考文獻)

        A、總順烏頭酸酶的提取

        稱取約0.1 g組織或收集500萬個細胞(細菌),加入1mL試劑一與10μL試劑三,用勻漿器或研缽于冰上勻漿。將勻漿置于冰上超聲波破碎(功率300W,超聲3秒,間隔9秒,重復15次),4℃,11000×g離心15min,取上清置于冰上待測(若以蛋白濃度計算,則需留出足夠量來測定蛋白濃度Cpr1)。用于測定總順烏頭酸酶活性(建議將樣本用蒸餾水稀釋4 -10倍后檢測)。

        B、胞漿與線粒體順烏頭酸酶的提取

        (1) 稱取約0.3 g組織或收集1500萬個細胞,加入1.5mL試劑一與15μL試劑三,用勻漿器或研缽于冰上勻漿。

        (2) 4℃600×g離心5min。(若以蛋白濃度計算,則需留出足夠量來測定蛋白濃度Cpr2

        (3) 將上清液移至另一離心管中,4℃11000×g離心15min。

        (4) 上清液即胞漿提取物,用于測定胞漿中的順烏頭酸酶活性(建議將樣本用蒸餾水稀釋4-10倍后檢測)。

        (5) 在沉淀中加入600μL試劑二與6μL試劑三,置于冰上超聲波破碎(功率300W,超聲3秒,間隔9秒,重復15次),4℃,5000×g離心2min,取上清置于冰上待測。用于測定線粒體中順烏頭酸酶活性(建議將樣本用蒸餾水稀釋4-10倍后檢測)。

        注意:根據(jù)實驗需要選擇性提取細胞總順烏頭酸酶、胞漿烏頭酸酶或線粒體烏頭酸酶。

        二、測定步驟

        1. 紫外分光光度計預熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至240nm,蒸餾水調(diào)零。

        2. 樣本測定

        (1) 將試劑四25℃預熱15 min以上;

        (2) 1mL石英比色皿中分別加入:

        試劑名稱(μL

        測定管

        試劑四

        900

        樣本

        100

        加入樣本即開始計時,立即混勻,于240nm處測定10s時的吸光值A1,迅速置于25℃水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱中反應5min,迅速取出比色皿并擦干,記錄5min10s時的吸光度A2,計算ΔA=A2-A1。

        三、順烏頭酸酶活性的計算

        1、總順烏頭酸酶活性計算:

        1)按樣本蛋白濃度計算

        酶活定義:每mg組織蛋白每分鐘凈生產(chǎn)1nmol順烏頭酸定義為一個酶活力單位。

        ACO酶活(U/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×106]÷(V×Cpr1) ÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr1×N

        (2) 按樣本質(zhì)量計算

        酶活定義:每g組織在反應體系中每分鐘凈生產(chǎn)1nmol順烏頭酸定義為一個酶活力單位。

        ACO酶活(U/g 質(zhì)量)=[ΔA×V反總÷ε×d×106]÷(V÷V提取×W÷T×N=561.11×ΔA÷W×N

        (3) 按照細菌或細胞數(shù)量計算

        酶活定義:每104個細菌或細胞在反應體系中每分鐘凈生產(chǎn)1nmol順烏頭酸定義為一個酶活力單位。

        ACO酶活(U/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×10 6]÷(V÷V提取×細胞數(shù)量(萬個))÷T×N

        =561.11×ΔA÷細胞數(shù)量(萬個)×N

        V反總:反應體系總體積,1×10-3L;ε:順烏頭酸消光系數(shù),3.6 L/mmol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.1mL;V提取:樣本總體積,1.01mL;T:反應時間,5min;Cpr1:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL106:單位換算系數(shù),1mmol=1×106nmol;N:稀釋倍數(shù)W:樣本質(zhì)量,g。

        2、胞漿順烏頭酸酶活性計算:

        1) 按樣本蛋白濃度計算

        酶活定義:每mg組織蛋白每分鐘凈生產(chǎn)1nmol順烏頭酸定義為一個酶活力單位。

        ACO酶活(U/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×106]÷(V×Cpr2) ÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr2×N

        (2) 按樣本質(zhì)量計算

        酶活定義:每g組織在反應體系中每分鐘凈生產(chǎn)1nmol順烏頭酸定義為一個酶活力單位。

        ACO酶活(U/g 質(zhì)量)=[ΔA×V反總÷ε×d×106]÷(V÷V提取×W÷T×N=841.67×ΔA÷W×N

         

        3) 按照細菌或細胞數(shù)量計算

        酶活定義:每104個細菌或細胞在反應體系中每分鐘凈生產(chǎn)1nmol順烏頭酸定義為一個酶活力單位。

        ACO酶活(U/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×106]÷V÷V提取×細胞數(shù)量(萬個)÷T×N

        =841.67×ΔA÷細胞數(shù)量(萬個)×N

        V反總:反應體系總體積,1×10-3L;ε:順烏頭酸消光系數(shù),3.6 L/mmol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.1mL;V提?。喊麧{樣本總體積,1.515mL;T:反應時間,5min;Cpr2:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;106:單位換算系數(shù),1mmol=1×106nmol;N:稀釋倍數(shù);W:樣本質(zhì)量,g。

        3、線粒體順烏頭酸酶活性計算:

        1) 按樣本蛋白濃度計算

        酶活定義:每mg組織蛋白每分鐘凈生產(chǎn)1nmol順烏頭酸定義為一個酶活力單位。

        ACO酶活(U/mg prot)= [ΔA×V反總÷ε×d×106]÷(V×Cpr2) ÷T×N= 555.55×ΔA÷Cpr2×N

        2按樣本質(zhì)量計算

        酶活定義:每g組織在反應體系中每分鐘凈生產(chǎn)1nmol順烏頭酸定義為一個酶活力單位。

        ACO酶活(U/g質(zhì)量)=[ΔA×V反總÷ε×d×106]÷(V÷V樣總×W÷T×N=336.67×ΔA÷W×N

        (3) 按照細菌或細胞數(shù)量計算

        酶活定義:每104個細菌或細胞在反應體系中每分鐘凈生產(chǎn)1nmol順烏頭酸定義為一個酶活力單位。

        ACO酶活(U/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×106]÷V÷V樣總×細胞數(shù)量(萬個))÷T×N

        =336.67×ΔA÷細胞數(shù)量(萬個)×N

        V反總:反應體系總體積,1×10-3L;ε:順烏頭酸消光系數(shù),3.6L/mmol/cmd:比色皿光徑,1cmV樣:加入樣本體積,0.1mL;V樣總:線粒體樣本總體積,0.606mLT:反應時間,5minCpr2:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;106:單位換算系數(shù),1mmol=1×106nmolN:稀釋倍數(shù);W:樣本質(zhì)量,g

        注意事項:

        1、 A大于1時,建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進行測定,并在計算時乘以相應的稀釋倍數(shù)。

        2、 ΔA小于0.01時,可適當延長反應時間,并在計算時將實際反應時間(T)帶入計算公式。

        3、 測定蛋白濃度時,由于試劑一本身含有蛋白(約1 mg/mL),所以測定時需要扣除此部分蛋白。

        實驗實例:

        1. 0.1g黑麥草樣本,加入1mL試劑一與10μL試劑三進行總順烏頭酸酶的提取,取上清稀釋4倍,測得ΔA=A2-A1=0.589-0.571=0.018,按樣本質(zhì)量計算總順烏頭酸酶的酶活得:

        ACO酶活(U/g 質(zhì)量)=561.11×ΔA÷W×N=403.999 U/g 質(zhì)量。

        2. 0.1g兔子腎臟樣本,加入1mL試劑一與10μL試劑三進行總順烏頭酸酶的提取,取上清稀釋8倍,測得ΔA=A2-A1=0.414-0.383=0.031,按樣本質(zhì)量計算總順烏頭酸酶的酶活得:

        ACO酶活(U/g 質(zhì)量)=561.11×ΔA÷W×N=1391.553 U/g 質(zhì)量。

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