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        • 蛋白質(zhì)二硫鍵含量檢測(cè)試劑盒 微量法
        產(chǎn)品名稱:

        蛋白質(zhì)二硫鍵含量檢測(cè)試劑盒 微量法

        產(chǎn)品品牌: SOLARBIO/索萊寶 價(jià)格:
        廠商性質(zhì): 生產(chǎn)廠家 產(chǎn)品時(shí)間: 2024-04-23
        有效期
        6個(gè)月
        儲(chǔ)存條件
        2-8℃
        中文名稱
        蛋白質(zhì)二硫鍵含量檢測(cè)試劑盒 微量法
        單位

        英文名稱
        Protein Disulfide Bond Content Assay Kit
        檢測(cè)方法
        微量法
        規(guī)格
        100T/48S
        自備試劑
        該試劑盒實(shí)驗(yàn)過程中需自備試劑,詳情見網(wǎng)站說明書

        產(chǎn)品概述

        品牌SOLARBIO/索萊寶CAS詳詢
        分子式詳詢純度詳詢
        分子量詳詢貨號(hào)BC5795
        規(guī)格100T/48S供貨周期現(xiàn)貨
        主要用途蛋白質(zhì)二硫鍵含量檢測(cè)應(yīng)用領(lǐng)域環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,綜合

        蛋白質(zhì)二硫鍵含量檢測(cè)試劑盒說明書

        微量法

        貨號(hào):BC5795

        規(guī)格:100T/48S

        產(chǎn)品組成:使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致,有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

        試劑名稱

        規(guī)格

        保存條件

        提取液一

        液體40 mL×1

        2-8℃保存

        提取液二

        液體40 mL×1

        2-8℃保存

        試劑一

        液體120 mL×1

        2-8℃保存

        試劑二

        液體20 mL×1

        2-8℃保存

        試劑三

        液體6 mL×1

        2-8℃保存

        試劑四

        液體1.2 mL×1

        2-8℃保存

        粉劑一

        粉劑×1

        2-8℃保存

        標(biāo)準(zhǔn)品

        粉劑×1

        2-8℃保存

        溶液的配制:

        1、 提取液配制:臨用前根據(jù)樣本量按照提取液一:提取液二=1mL1 mL進(jìn)行配制,勿一次性全部混合。

        2、 若試劑二有析出,可置于37℃水浴加熱至澄清透明后使用。

        3、 標(biāo)準(zhǔn)品:10mg還原型谷*甘肽(GSH)。臨用前加入1.3mL蒸餾水配25μmol/mL2-8℃保存4。

        4、 0.125μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品配制:取50μL 25μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品,加入950μL蒸餾水,充分混勻,配制成1.25μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)品;然后取100μL 1.25μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品,加入900μL蒸餾水,充分混勻,配制成0.125μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)品使用,現(xiàn)配現(xiàn)用。

        產(chǎn)品說明:

        蛋白質(zhì)是一類重要的生物大分子,存在于一切生物體內(nèi),是生命的基礎(chǔ)物質(zhì)。二硫鍵是連接不同肽鏈或同一肽鏈中,兩個(gè)不同半胱氨*殘基的巰基的化學(xué)鍵。二硫鍵對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)影響很大,在蛋白質(zhì)分子中,起著穩(wěn)定肽鏈空間結(jié)構(gòu)的作用,所以測(cè)定蛋白質(zhì)二硫鍵含量尤為重要。

        還原劑會(huì)使二硫鍵裂解,裂解后的巰基會(huì)發(fā)生親核反應(yīng),即巰基與5,5’-二硫代--硝基苯甲酸(DTNB)反應(yīng),生成黃色化合物,在412nm處有最大吸收峰,據(jù)此可以計(jì)算蛋白質(zhì)二硫鍵含量。


        注意:實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

        需自備的儀器和用品

        可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、天平、低溫離心機(jī)、研缽/勻漿器、丙酮(AR)、蒸餾水。

        操作步驟

         

        一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn))

        1. 組織:按照質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴勻漿后于4℃,3000rpm 離心10min,棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一,攪勻后溶解沉淀,沉淀溶解液作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(注:(1)植物葉片等纖維含量較高的樣本,溶解沉淀后4℃ 3000rpm離心3min,取上清作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn),;(2)加入試劑一后會(huì)有大量氣泡產(chǎn)生,請(qǐng)緩慢加入,建議使用5mLEP)。

        2. 細(xì)菌/細(xì)胞:按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量(106個(gè)):提取液體積(mL)為5~101的比例(建議5百萬細(xì)菌/細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎(功率200W,超聲3秒,間隔10秒,總時(shí)間3min,4℃,3000rpm 離心10min,棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一,攪勻后溶解沉淀,沉淀溶解液作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。注:1若沉淀溶解不全,可4℃ 3000rpm離心3min,取上清作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn);(2)加入試劑一后會(huì)有大量氣泡產(chǎn)生,請(qǐng)緩慢加入,建議使用5mLEP。

        3. 血清/血漿、牛奶等液體:100μL液體樣本加入0.9mL丙酮4℃,3000rpm 離心10min,棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一,攪勻后溶解沉淀,沉淀溶解液作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(注:若測(cè)定數(shù)值偏小,可改變樣本與丙酮的比例,如0.2mL液體樣本加入0.8mL丙酮或0.3mL液體樣本加入0.7mL丙酮,注意同步修改計(jì)算公式)。

        二、測(cè)定步驟

        1、 可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至412nm,分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

        2、 操作表:(建議在2mLEP管中操作

        試劑名稱(mL

        對(duì)照管

        測(cè)定管

        空白管

        標(biāo)準(zhǔn)管


        樣本

        0.3

        0.3

        -

        -


        蒸餾水

        -

        -

        0.3

        -


        標(biāo)準(zhǔn)品

        -

        -

        -

        0.3


        粉劑一

        -

        3mg

        -

        -


        開蓋反應(yīng)30min,期間每隔10min用吸頭吹打至氣泡不再產(chǎn)生,禁止扣蓋反應(yīng)

        -

        -


        提取液

        0.18

        0.18

        0.18

        0.18


        請(qǐng)緩慢加入提取液混勻,并用吸頭反復(fù)吹打至氣泡不再產(chǎn)生(期間會(huì)有大量氣泡產(chǎn)生,開蓋放置)


        試劑二

        0.18

        0.18

        0.18

        0.18


        充分混勻,4℃ 3000rpm離心10min后取上清于1.5mL EP/96孔板中

        -

        -

        上清液

        0.14

        0.14

        0.14

        0.14


        試劑三

        0.05

        0.05

        0.05

        0.05


        充分混勻,測(cè)定412nm下的吸光度,分別記為A1對(duì)照、A1測(cè)定。

        -

        -


        試劑四

        0.01

        0.01

        0.01

        0.01


        充分混勻,室溫靜置10min后測(cè)定412nm下的吸光度,分別記為A2對(duì)照、A2測(cè)定、A空白、A標(biāo)準(zhǔn)。計(jì)算ΔA測(cè)定=A2測(cè)定-A1測(cè)定)-A2對(duì)照-A1對(duì)照),ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白??瞻坠芎蜆?biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)1-2次。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

        注:第一步測(cè)定412nm吸光度時(shí),可將反應(yīng)液全部倒入96孔板中/微量玻璃比色皿中測(cè)定,之后可直接在96孔板中/微量玻璃比色皿中加入試劑四混勻后繼續(xù)測(cè)定。


        三、蛋白質(zhì)二硫鍵含量的計(jì)算

         

         

         

        1. 按照樣本蛋白濃度計(jì)算:

        蛋白質(zhì)二硫鍵含量(μmol/mg prot=ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn))×V樣本÷V樣本×Cpr÷2×F

        =0.0625× ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×Cpr×F

        2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算:

        蛋白質(zhì)二硫鍵含量(μmol/g 質(zhì)量)=ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn))×V試劑一÷W÷2×F

        =0.125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F

        3. 按照液體體積計(jì)算:

        蛋白質(zhì)二硫鍵含量(μmol/mL=ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn))×V試劑一÷V液樣÷2×F

        =1.25×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×F

        4. 按照細(xì)胞/細(xì)菌數(shù)量計(jì)算:

        蛋白質(zhì)二硫鍵含量(μmol /106 cell=ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn))×V試劑一÷N÷2×F
        =0.125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N×F

        C標(biāo)準(zhǔn):標(biāo)準(zhǔn)管濃度,0.125μmol/mL;V樣本:加入的樣本體積,0.3mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL,蛋白濃度需自行測(cè)定,可以使用BCA方法測(cè)定;W:樣本質(zhì)量,gV試劑一:提取時(shí)加入試劑一體積,2mLV液樣:提取時(shí)加入的樣本體積,0.1mL;2:一個(gè)二硫鍵裂解產(chǎn)生兩個(gè)巰基;F:稀釋倍數(shù);N:細(xì)胞/細(xì)菌總數(shù),以106計(jì)。

        注意事項(xiàng):

        1. 若樣本Δ測(cè)定A<0.01,可適當(dāng)增大樣本量后測(cè)定,注意同步修改空白管和標(biāo)準(zhǔn)管及計(jì)算公式;若樣本ΔA測(cè)定>1.5,可用試劑一稀釋沉淀溶解液后測(cè)定,注意同步修改計(jì)算公式中的稀釋倍數(shù)。

        實(shí)驗(yàn)實(shí)例:

        1、 100μL馬血清,按照測(cè)定步驟操作,用96孔板測(cè)得ΔA測(cè)定=A2測(cè)定-A1測(cè)定)-A2對(duì)照-A1對(duì)照)=0.348-0.113-0.047-0.045=0.233,ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.417-0.105=0.312,按樣本液體體積計(jì)算蛋白質(zhì)二硫鍵含量得:

        蛋白質(zhì)二硫鍵含量(μmol/mL= 1.25×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×F =0.933μmol/mL。

        2、 0.1036g鼠肝,按照測(cè)定步驟操作,用96孔板測(cè)得ΔA測(cè)定=A2測(cè)定-A1測(cè)定)-A2對(duì)照-A1對(duì)照)=0.475-0.107-0.261-0.105=0.212ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.417-0.105=0.312,按樣本質(zhì)量計(jì)算蛋白質(zhì)二硫鍵含量得:

        蛋白質(zhì)二硫鍵含量(μmol/g 質(zhì)量=0.125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F =0.820μmol/g 質(zhì)量。

        3、 0.1078g黃豆粉,沉淀溶解液用試劑一稀釋2倍后,按照測(cè)定步驟操作,用96孔板測(cè)得ΔA測(cè)定=A2測(cè)定-A1測(cè)定)-A2對(duì)照-A1對(duì)照)=0.762-0.084-0.123-0.070=0.625ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.417-0.105=0.312,按樣本質(zhì)量計(jì)算蛋白質(zhì)二硫鍵含量得:

        蛋白質(zhì)二硫鍵含量(μmol/g 質(zhì)量=0.125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F =4.646μmol/g 質(zhì)量

        相關(guān)系列產(chǎn)品:

        BC1370/BC1375  總巰基含量檢測(cè)試劑盒

        BC1430/BC1435  非蛋白巰基含量檢測(cè)試劑盒

        BC5800/BC5805  蛋白質(zhì)總巰基含量檢測(cè)試劑盒

        BC5890/BC5895  蛋白質(zhì)游離巰基含量檢測(cè)試劑盒

        蛋白質(zhì)二硫鍵含量檢測(cè)試劑盒 微量法 蛋白質(zhì)二硫鍵含量檢測(cè)試劑盒 微量法


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