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        • 丙酮酸磷酸雙激酶活性檢測試劑盒 微量法
        產(chǎn)品名稱:

        丙酮酸磷酸雙激酶活性檢測試劑盒 微量法

        產(chǎn)品品牌: SOLARBIO/索萊寶 價格:
        廠商性質(zhì): 生產(chǎn)廠家 產(chǎn)品時間: 2024-04-23
        有效期
        6個月
        儲存條件
        -20℃
        中文名稱
        丙酮酸磷酸雙激酶活性檢測試劑盒 微量法
        單位

        推薦
        若使用96孔板測定,需使用96孔UV板,推薦貨號YA0602
        英文名稱
        Pyruvate Phosphate Dikinase(PPDK)Activity Assay Kit
        檢測方法
        微量法
        規(guī)格
        100T/96S

        產(chǎn)品概述

        品牌SOLARBIO/索萊寶CAS詳詢
        分子式詳詢純度詳詢
        分子量詳詢貨號BC5855
        規(guī)格100T/96S供貨周期現(xiàn)貨
        主要用途丙酮酸磷酸雙激酶活性檢測應(yīng)用領(lǐng)域環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,綜合

        丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)活性檢測試劑盒說明書

        微量法

        貨號:BC5855

        規(guī)格:100T/96S

        產(chǎn)品組成:使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

        試劑名稱

        規(guī)格

        保存條件

        提取液

        液體110 mL×1

        2-8℃保存

        試劑一

        液體15 mL×1

        2-8℃保存

        試劑二

        粉劑×1

        -20℃保存

        試劑三

        液體1.1 mL×1

        2-8℃保存

        試劑四

        粉劑×1

        2-8℃保存

        試劑五

        粉劑×1

        -20℃保存

        試劑六

        液體45 μL×1

        2-8℃保存

        溶液的配制:

        1、 試劑二:臨用前加入1.1mL蒸餾水充分溶解,未用完的試劑-20℃分裝保存4周,避免反復(fù)凍融。

        2、 試劑四:臨用前加入1.1mL蒸餾水充分溶解,未用完的試劑-20℃分裝保存4周,避免反復(fù)凍融。

        3、 試劑五:臨用前加入1.25mL蒸餾水充分溶解,未用完的試劑-20℃分裝保存4周,避免反復(fù)凍融。

        4、 試劑六工作液:臨用根據(jù)樣本量按照試劑六:蒸餾水=5μL120μL(共125μL,25T)的比例配制成,現(xiàn)配現(xiàn)用。

        5、 工作液的配制:臨用前按樣本量將試劑二:試劑三:試劑四:試劑五:試劑六工作液=0.25mL0.25mL0.25mL0.25mL0.25mL(共1.25mL,約25T)配制成工作液使用,現(xiàn)配現(xiàn)用。

        產(chǎn)品說明:

        丙酮酸磷酸雙激酶(pyruvate phosphate dikinase,PPDK,EC 2.7.9.1)是C4途徑和景天科酸代謝途徑的限速酶,催化ATP、丙酮酸和Pi經(jīng)三步反應(yīng)生成磷酸烯醇式丙酮酸。該酶主要存在于C4植物的葉綠體基質(zhì)中,對光合功能具有重要調(diào)節(jié)作用。

        PPDK的逆向反應(yīng)催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、AMPPPi生成丙酮酸、ATPPi,乳酸脫氫酶(LDH)進一步催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+,在340nm測定NADH減少速率,據(jù)此可以計算PPDK活性。


        注意:實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

        需自備的儀器和用品

        紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96UV板、天平、低溫離心機、水浴鍋、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

         

         

        操作步驟:

        一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,具體比例可以參考文獻

        1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)

        進行冰浴勻漿。12000g,4℃離心 10min,取上清置于冰上待測。

        二、測定步驟

        1、 紫外分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,分光光度計用蒸餾水調(diào)零。

        2、 試劑一37℃預(yù)熱10min.

        3、 操作表:(在微量石英比色皿/96UV板中依次加入)

        試劑名稱(μL

        空白管

        測定管

        試劑一

        130

        130

        工作液

        50

        50

        樣本

        -

        20

        提取液

        20

        -

        在微量石英比色皿/96UV板中分別加入上述試劑,充分混勻后記錄340nm10s時的初始吸光度A1空白、A1測定,之后迅速將比色皿連同反應(yīng)液一起置于37℃水浴中準確反應(yīng)5min,迅速取出,340nm下記錄5min10s時的吸光度A2空白、A2測定,計算ΔA測定=A1測定-A2測定,ΔA空白=A1空白-A2空白,ΔA=ΔA測定-ΔA空白。空白管只需做1-2次。

        三、丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)計算公式

        1. 使用96UV板測定:

        (1) 按樣本蛋白濃度計算:

        酶活定義:每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘減少1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

        PPDK活性(U/mg prot=ΔA÷ε×d×V×109÷Cpr×V樣)÷T×F =535.91×ΔA÷Cpr×F

        (2) 按樣本質(zhì)量計算:

        酶活定義:每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘減少1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

        PPDK活性(U/g 質(zhì)量)=ΔA÷ε×d×V×109÷W÷V提取×V樣)÷T×F =535.91×ΔA÷W×F

        εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L/(mol·cm)d96孔板光徑,0.6cm;V反:反應(yīng)體系體積,2×10-4L;V樣:反應(yīng)體系中加入的樣本體積,0.02mL;V提?。杭尤胩崛∫旱捏w積,1mL;T:反應(yīng)時間,5min;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;F:稀釋倍數(shù);109:單位換算,1mol=109nmol。

        2. 使用微量比色皿測定:

        將上述公式中的d=0.6cm改為d=1cm(微量比色皿光徑)進行計算即可。

        注意事項:

        1. 測定過程中樣本和工作液在冰上放置,以免變性和失活。

        2. 最好兩個人同時做此實驗,一個人比色,一個人計時,以保證實驗結(jié)果的準確性。

        3. 當(dāng)樣本ΔA0.005時,可適當(dāng)延長酶促反應(yīng)時間或增大樣本量后測定;當(dāng)樣本ΔA>0.6時,可用蒸餾水稀釋上清液后測定,注意同步修改計算公式中的稀釋倍數(shù)。

        實驗實例:


        1、 0.1014g高粱葉片加入1mL提取液進行冰浴勻漿,取上清用蒸餾水稀釋4倍后,按照測定步驟操作,用96UV板測得ΔA空白=A空白1-A空白2=0.754-0.749=0.005,ΔA測定=A測定1-A測定2=0.811-0.478=0.333ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.333-0.005=0.328,按樣本質(zhì)量計算PPDK活性得:

        PPDK活性(U/g 質(zhì)量)=535.91×ΔA÷W×F =6934.06 U/g 質(zhì)量。

        2、 0.1086g柚子葉片加入1mL提取液進行冰浴勻漿,取上清后按照測定步驟操作,用96UV板測得ΔA空白=A空白1-A空白2=0.754-0.749=0.005,ΔA測定=A測定1-A測定2=1.849-1.530=0.319ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.319-0.005=0.314,按樣本質(zhì)量計算PPDK活性得:

        PPDK活性(U/g 質(zhì)量)= 535.91×ΔA÷W×F =1549.50U/g 質(zhì)量。

        參考文獻:

        [1] Chris J. Chastain and others, Functional evolution of C4 pyruvate, orthophosphate dikinase, Journal of Experimental Botany, Volume 62, Issue 9, May 2011, Pages 3083–3091

        [2] Chastain, C.J., Heck, J.W., Colquhoun, T.A. et al. Posttranslational regulation of pyruvate, orthophosphate dikinase in developing rice (Oryza sativa) seeds. Planta 224, 924–934 (2006).

        [3] Aoyagi K, Bassham JA. Pyruvate orthophosphate dikinase in wheat leaves. Plant Physiol. 1983 Nov;73(3):853-4.

        相關(guān)系列產(chǎn)品:

        BC0380/BC0385  丙酮酸脫氫酶(PDH)活性檢測試劑盒

        BC1060/BC1065  檸檬酸合酶(CS)活性檢測試劑盒

        BC6020/BC6025  乙酰輔*A羧化酶(ACC)活性檢測試劑盒(酶法)

        丙酮酸磷酸雙激酶活性檢測試劑盒 微量法  丙酮酸磷酸雙激酶活性檢測試劑盒 微量法

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