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        • 甲基檸檬酸合酶活性檢測試劑盒 三羧酸
        產(chǎn)品名稱:

        甲基檸檬酸合酶活性檢測試劑盒 三羧酸

        產(chǎn)品品牌: SOLARBIO/索萊寶 價格:
        廠商性質(zhì): 生產(chǎn)廠家 產(chǎn)品時間: 2024-04-23
        有效期
        6個月
        儲存條件
        -20℃
        中文名稱
        甲基檸檬酸合酶活性檢測試劑盒 三羧酸
        單位

        英文名稱
        Methylcitrate Synthase(MCS)Activity Assay Kit
        檢測方法
        可見分光光度法
        規(guī)格
        50T/24S

        產(chǎn)品概述

        品牌SOLARBIO/索萊寶CAS詳詢
        分子式詳詢純度詳詢
        分子量詳詢貨號BC5860
        規(guī)格50T/24S供貨周期現(xiàn)貨
        主要用途甲基檸檬酸合酶活性檢測應(yīng)用領(lǐng)域環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,綜合

        甲基檸檬酸合酶(MCS)活性檢測試劑盒說明書

        可見分光光度法

        貨號:BC5860

        規(guī)格:50T/24S

        產(chǎn)品組成:使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

        試劑名稱

        規(guī)格

        保存條件

        提取液

        液體30mL×1

        -20℃保存

        試劑一

        液體0.3mL×1

        -20℃保存

        試劑二

        液體60mL×1

        2-8℃保存

        試劑三

        液體2.5mL×1

        2-8℃保存

        試劑四

        粉劑×1

        -20℃保存

        試劑五

        粉劑×1

        -20℃保存

        溶液的配制:

        1、 試劑四:臨用前加入1.5mL蒸餾水充分溶解,未用完的試劑-20℃分裝保存4周,避免反復(fù)凍融。

        2、 試劑五:試劑放于棕色瓶內(nèi)玻璃瓶中,臨用前加入3mL蒸餾水充分溶解,未用完的試劑-20℃分裝保存4周,避免反復(fù)凍融。

        產(chǎn)品說明:

        甲基檸檬酸合酶(metheyl-citrate synthaseMCS)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中,與檸檬酸合酶(CS)共同參與三羧酸循環(huán)的調(diào)節(jié)。

        MCS 催化丙酰CoA和草酰乙酸產(chǎn)生甲基檸檬酰輔*A,進(jìn)一步水解產(chǎn)生甲基檸檬酸;該反應(yīng)促使無色的DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB,在412nm處有特征吸收峰,據(jù)此可以計算MCS活性。


        注意:實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

        需自備的儀器和用品:

        可見分光光度計、1mL玻璃比色皿、天平、低溫離心機(jī)、水浴鍋、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

        操作步驟:

        一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn)

        1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)和10μL試劑一,進(jìn)行冰浴勻漿。12000g,4℃離心10min,取上清置于冰上待測。

        2. 細(xì)菌/細(xì)胞:按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量(106個):提取液體積(mL)為5~101的比例(建議5百萬細(xì)菌/細(xì)胞加入1mL提取液和10μL試劑一),冰浴超聲波破碎(功率200W,超聲3秒,間隔7秒,總時間5min);然后12000 g4℃離心10min,取上清置于冰上待測。

         

        二、測定步驟

        1、 可見分光光度計預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至412nm,蒸餾水調(diào)零。

        2、 試劑二置于37℃水浴中預(yù)熱15min。

        3、 操作表:在1mL玻璃比色皿或1.5mL EP管中分別加入(適用于測定動物組織樣本

        試劑名稱(μL

        對照管

        測定管

        試劑二

        930

        800

        試劑三

        35

        35

        試劑四

        -

        40

        樣本

        35

        35

        試劑五

        -

        90

        1mL玻璃比色皿或1.5mL EP管中分別加入上述試劑,充分混勻后記錄412nm10s時的初始吸光度A1對照、A1測定,之后迅速將比色皿連同反應(yīng)液一起置于37℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5min,迅速取出比色皿并擦干,412nm下記錄5min10s時的吸光度A2對照、A2測定,計算ΔA=A2測定-A1測定)-A2對照-A1對照)。

        4、 操作表:在1mL玻璃比色皿或1.5mL EP管中分別加入(適用于測定微生物和植物組織樣本

        試劑名稱(μL

        對照管

        測定管

        試劑二

        765

        635

        試劑三

        35

        35

        試劑四

        -

        40

        樣本

        200

        200

        試劑五

        -

        90

        1mL玻璃比色皿或1.5mL EP管中分別加入上述試劑,充分混勻后記錄412nm10s時的初始吸光度A1對照、A1測定,之后迅速將比色皿連同反應(yīng)液一起置于37℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)30min,迅速取出比色皿并擦干,412nm下記錄30min10s時的吸光度A2對照、A2測定,計算ΔA=A2測定-A1測定)-A2對照-A1對照)。

        注:在1.5mL EP管中進(jìn)行反應(yīng)時,可參考以下步驟:先將比色皿置于分光光度計中,然后將反應(yīng)液混勻后迅速加入1mL玻璃比色皿中,記錄412nm10s時的初始吸光度A1對照、A1測定,之后迅速將反應(yīng)液吸取到1.5mL EP管中,置于37℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)30min,迅速取出EP管并擦干,412nm下記錄30min10s時的吸光度A2對照、A2測定。

        三、甲基檸檬酸合酶(MCS)計算公式

        1. 動物組織樣本:

        1)按樣本蛋白濃度計算:

        酶活定義:每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。

        MCS活性(U/mg prot=ΔA÷ε×d×V÷Cpr×V樣)÷T=420.17×ΔA÷Cpr

        2)按樣本質(zhì)量計算:

        酶活定義:每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。

        MCS活性(U/g 質(zhì)量)=ΔA÷ε×d×V÷W÷V提取×V樣)÷T=424.37×ΔA÷W

        εTNB摩爾消光系數(shù),13.6×10-3mL/(nmol·cm);d:比色皿光徑,1cmV反:反應(yīng)體系體積,1mL;V樣:反應(yīng)體系中加入的樣本體積,0.035mL;V提?。杭尤胩崛∫杭霸噭┮坏捏w積,1.01mLT:反應(yīng)時間,5min;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g。

         

         

         

        2. 微生物和植物組織樣本:

        1)按樣本蛋白濃度計算:

        酶活定義:每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。

        MCS活性(U/mg prot=ΔA÷ε×d×V÷Cpr×V樣)÷T=12.25×ΔA÷Cpr

        2)按樣本質(zhì)量計算:

        酶活定義:每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。

        MCS活性(U/g 質(zhì)量)=ΔA÷ε×d×V÷W÷V提取×V樣)÷T=12.38×ΔA÷W

        3)按細(xì)菌/細(xì)胞計算:

        酶活定義:每106個細(xì)菌/細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。

        MCS活性(U/106 cell=ΔA÷ε×d×V÷N÷V提取×V樣)÷T = 12.38×ΔA÷N

        εTNB摩爾消光系數(shù),13.6×10-3mL/(nmol·cm)d:比色皿光徑,1cmV反:反應(yīng)體系體積,1mL;V樣:反應(yīng)體系中加入的樣本體積,0.2mL;V提?。杭尤胩崛∫杭霸噭┮坏捏w積,1.01mL;T:反應(yīng)時間,30min;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;N:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),以106計。

        注意事項:

        1. 測定過程中樣本和所有試劑在冰上放置,以免變性和失活。

        2. 最好兩個人同時做此實驗,一個人比色,一個人計時,以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

        3. 由于提取液含有蛋白成分(約1mg/mL),故測定蛋白濃度時需要同時測定提取液的蛋白濃度。

        4. 當(dāng)樣本ΔA0.01時,可適當(dāng)延長酶促反應(yīng)時間或增大樣本量后測定,注意同步修改計算公式。

        5. 當(dāng)樣本ΔA>1A>1.5時,可將樣本用提取液適當(dāng)稀釋后測定,注意同步修改計算公式。

        實驗實例:

        1、 0.0918g小鼠心臟加入1mL提取液和10μL試劑一進(jìn)行冰浴勻漿,取上清用后按照測定步驟操作,用1mL玻璃比色皿測得ΔA=A2測定-A1測定)-A2對照-A1對照)=0.930-0.339-0.333-0.294=0.552,按樣本質(zhì)量計算MCS活性得:

        MCS活性(U/g 質(zhì)量)= 424.37×ΔA÷W =2551.76U/g 質(zhì)量。

        2、 0.1186g霉菌加入1mL提取液和10μL試劑一進(jìn)行冰浴勻漿,取上清后按照測定步驟操作,用1mL玻璃比色皿測得ΔA=A2測定-A1測定)-A2對照-A1對照)=0.536-0.396-0.357-0.376=0.159按樣本質(zhì)量計算MCS活性得:

        MCS活性(U/g 質(zhì)量)=12.38×ΔA÷W =16.60 U/g 質(zhì)量。

        3、 0.1013g竹葉加入1mL提取液和10μL試劑一進(jìn)行冰浴勻漿,取上清后按照測定步驟操作,用1mL玻璃比色皿測得ΔA=A2測定-A1測定)-A2對照-A1對照)=0.477-0.413-0.411-0.403=0.056,按樣本質(zhì)量計算MCS活性得:

        MCS活性(U/g 質(zhì)量)=12.38×ΔA÷W =6.844 U/g 質(zhì)量。

        參考文獻(xiàn):

        [1] Maerker, C, et al. "Methylcitrate synthase from Aspergillus fumigatus. Propionyl-CoA affects polyketide synthesis, growth and morphology of conidia. " Febs Journal 272.14(2010):3615-3630.

         

        [2] Watson, D., Lindel, D.L. & Fall, R. Pseudomonas aeruginosa contains an inducible methylcitrate synthase. Current Microbiology 8, 17–21 (1983).

        相關(guān)系列產(chǎn)品:

        BC0380/BC0385  丙酮酸脫氫酶(PDH)活性檢測試劑盒

        BC1060/BC1065  檸檬酸合酶(CS)活性檢測試劑盒

        BC6020/BC6025 乙酰輔*A羧化酶(ACC)活性檢測試劑盒(酶法)

        甲基檸檬酸合酶活性檢測試劑盒 三羧酸 甲基檸檬酸合酶活性檢測試劑盒 三羧酸

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