甲基檸檬酸合酶（MCS）活性檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

貨號：BC5860

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑四：臨用前加入1.5mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

2、 試劑五：試劑放于棕色瓶內(nèi)玻璃瓶中，臨用前加入3mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品說明：

甲基檸檬酸合酶（metheyl-citrate synthase，MCS）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中，與檸檬酸合酶（CS）共同參與三羧酸循環(huán)的調(diào)節(jié)。

MCS 催化丙酰CoA和草酰乙酸產(chǎn)生甲基檸檬酰輔*A，進(jìn)一步水解產(chǎn)生甲基檸檬酸；該反應(yīng)促使無色的DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB，在412nm處有特征吸收峰，據(jù)此可以計算MCS活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、1mL玻璃比色皿、天平、低溫離心機(jī)、水浴鍋、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）和10μL試劑一，進(jìn)行冰浴勻漿。12000g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測。

2. 細(xì)菌/細(xì)胞：按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（10⁶個）：提取液體積（mL）為5~10：1的比例（建議5百萬細(xì)菌/細(xì)胞加入1mL提取液和10μL試劑一），冰浴超聲波破碎（功率200W，超聲3秒，間隔7秒，總時間5min）；然后12000 g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至412nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 試劑二置于37℃水浴中預(yù)熱15min。

3、 操作表：在1mL玻璃比色皿或1.5mL EP管中分別加入（適用于測定動物組織樣本）

4、 操作表：在1mL玻璃比色皿或1.5mL EP管中分別加入（適用于測定微生物和植物組織樣本）

注：在1.5mL EP管中進(jìn)行反應(yīng)時，可參考以下步驟：先將比色皿置于分光光度計中，然后將反應(yīng)液混勻后迅速加入1mL玻璃比色皿中，記錄412nm下10s時的初始吸光度A1對照、A1測定，之后迅速將反應(yīng)液吸取到1.5mL EP管中，置于37℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)30min，迅速取出EP管并擦干，412nm下記錄30min10s時的吸光度A2對照、A2測定。

三、甲基檸檬酸合酶（MCS）計算公式

1. 動物組織樣本：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

酶活定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。

MCS活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（Cpr×V樣）÷T=420.17×ΔA÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算：

酶活定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。

MCS活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（W÷V提取×V樣）÷T=424.37×ΔA÷W

ε：TNB摩爾消光系數(shù)，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；d：比色皿光徑，1cm；V反：反應(yīng)體系體積，1mL；V樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.035mL；V提?。杭尤胩崛∫杭霸噭┮坏捏w積，1.01mL；T：反應(yīng)時間，5min；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。

2. 微生物和植物組織樣本：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

酶活定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。

MCS活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（Cpr×V樣）÷T=12.25×ΔA÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算：

酶活定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。

MCS活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（W÷V提取×V樣）÷T=12.38×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌/細(xì)胞計算：

酶活定義：每10⁶個細(xì)菌/細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。

MCS活性（U/10⁶ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（N÷V提取×V樣）÷T = 12.38×ΔA÷N

ε：TNB摩爾消光系數(shù)，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；d：比色皿光徑，1cm；V反：反應(yīng)體系體積，1mL；V樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.2mL；V提?。杭尤胩崛∫杭霸噭┮坏捏w積，1.01mL；T：反應(yīng)時間，30min；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，以10⁶計。

注意事項：

1. 測定過程中樣本和所有試劑在冰上放置，以免變性和失活。

2. 最好兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3. 由于提取液含有蛋白成分（約1mg/mL），故測定蛋白濃度時需要同時測定提取液的蛋白濃度。

4. 當(dāng)樣本ΔA＜0.01時，可適當(dāng)延長酶促反應(yīng)時間或增大樣本量后測定，注意同步修改計算公式。

5. 當(dāng)樣本ΔA>1或A>1.5時，可將樣本用提取液適當(dāng)稀釋后測定，注意同步修改計算公式。

實驗實例：

1、 取0.0918g小鼠心臟加入1mL提取液和10μL試劑一進(jìn)行冰浴勻漿，取上清用后按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得ΔA=（A2測定-A1測定）-（A2對照-A1對照）=（0.930-0.339）-（0.333-0.294）=0.552，按樣本質(zhì)量計算MCS活性得：

MCS活性（U/g 質(zhì)量）= 424.37×ΔA÷W =2551.76U/g 質(zhì)量。

2、 取0.1186g霉菌加入1mL提取液和10μL試劑一進(jìn)行冰浴勻漿，取上清后按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得ΔA=（A2測定-A1測定）-（A2對照-A1對照）=（0.536-0.396）-（0.357-0.376）=0.159，按樣本質(zhì)量計算MCS活性得：

MCS活性（U/g 質(zhì)量）=12.38×ΔA÷W =16.60 U/g 質(zhì)量。

3、 取0.1013g竹葉加入1mL提取液和10μL試劑一進(jìn)行冰浴勻漿，取上清后按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得ΔA=（A2測定-A1測定）-（A2對照-A1對照）=（0.477-0.413）-（0.411-0.403）=0.056，按樣本質(zhì)量計算MCS活性得：

MCS活性（U/g 質(zhì)量）=12.38×ΔA÷W =6.844 U/g 質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1] Maerker, C, et al. "Methylcitrate synthase from Aspergillus fumigatus. Propionyl-CoA affects polyketide synthesis, growth and morphology of conidia. " Febs Journal 272.14(2010):3615-3630.

[2] Watson, D., Lindel, D.L. & Fall, R. Pseudomonas aeruginosa contains an inducible methylcitrate synthase. Current Microbiology 8, 17–21 (1983).

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