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        • 一氧化氮合成酶活性檢測(cè)試劑盒 信號(hào)
        產(chǎn)品名稱:

        一氧化氮合成酶活性檢測(cè)試劑盒 信號(hào)

        產(chǎn)品品牌: SOLARBIO/索萊寶 價(jià)格:
        廠商性質(zhì): 生產(chǎn)廠家 產(chǎn)品時(shí)間: 2024-04-23
        單位

        中文名稱
        一氧化氮合成酶活性檢測(cè)試劑盒 信號(hào)
        儲(chǔ)存條件
        -20℃
        有效期
        6個(gè)月
        英文名稱
        Nitric Oxide Synthase (NOS) Activity Assay kit
        檢測(cè)方法
        可見(jiàn)分光光度法
        規(guī)格
        50T/48S

        產(chǎn)品概述

        品牌SOLARBIO/索萊寶CAS詳詢
        分子式詳詢純度詳詢
        分子量詳詢貨號(hào)BC5680
        規(guī)格50T/48S供貨周期現(xiàn)貨
        主要用途一氧化氮合成酶(NOS)活性檢測(cè)應(yīng)用領(lǐng)域環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,綜合

        一氧化氮合成酶(NOS)活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

        可見(jiàn)分光光度法

        貨號(hào):BC5680

        規(guī)格:50T/48S

        產(chǎn)品組成:使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致,有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

        試劑名稱

        規(guī)格

        保存條件

        提取液一

        液體60 mL×1

        -20℃保存

        提取液二

        液體0.6 mL×2

        -20℃保存

        緩沖液

        液體30 mL×1

        2-8℃保存

        試劑一

        液體8 mL×1

        2-8℃保存

        試劑二

        粉劑×2

        -20℃保存

        試劑三

        液體50 μL×1

        2-8℃保存

        試劑四

        粉劑×2

        -20℃保存

        試劑五

        粉劑×2

        -20℃保存

        試劑六

        液體2.5 mL×1

        2-8℃保存

        試劑七

        液體55 μL×1

        2-8℃保存

        顯色液A

        液體15 mL×1

        2-8℃保存

        顯色液B

        液體15 mL×1

        2-8℃保存

        標(biāo)準(zhǔn)品

        液體1 mL×1

        2-8℃保存

        溶液的配制:

        1. 提取液二:為易揮發(fā)試劑,用完后盡快密封,-20℃保存;

        2. 試劑二:試劑放于瓶?jī)?nèi)玻璃瓶中,臨用前取1瓶加入6mL緩沖液,-20℃分裝可保存4周,避免反復(fù)凍融;

        3. 試劑三工作液:臨用前根據(jù)樣本量按試劑三:緩沖液=4μL396μL400μL,5T)的比例配制,現(xiàn)用現(xiàn)配;

        4. 試劑四:臨用前取1支試劑四加入0.6mL緩沖液,-20℃分裝可保存4周,避免反復(fù)凍融;

        5. 試劑五:試劑放于瓶?jī)?nèi)玻璃瓶中,臨用前取1支試劑五加入2.4mL緩沖液,-20℃分裝可保存4周,避免反復(fù)凍融;

        6. 工作液:臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照試劑一:試劑二:試劑三工作液:試劑四:試劑五=0.6mL1.0mL0.4mL0.1mL0.4mL2.5mL5T)的比例配制工作液,現(xiàn)用現(xiàn)配;

        7. 試劑七工作液:臨用前根據(jù)樣本量按試劑七:緩沖液=10μL450μL(0.46mL,約11T)的比例配制,現(xiàn)用現(xiàn)配;

        8. 顯色液:臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照顯色液A液:顯色液B=1:1充分混勻,現(xiàn)配現(xiàn)用;

        9. 標(biāo)準(zhǔn)品:10μmol/mL亞*酸鈉。臨用前取5μL 10μmol/mL亞*酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液,加入995μL蒸餾水,配制成0.05μmol/mL亞*酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

        注:試劑二、試劑四、試劑五為凍干試劑,可能存在肉眼觀察試劑量相差較大甚至量很少的現(xiàn)象,此現(xiàn)象不影響使用,實(shí)際質(zhì)量相同。

        產(chǎn)品說(shuō)明:

         

        一氧化氮合成酶(Nitric Oxide SynthaseNOS,EC 1.14.13.39)是生物體內(nèi)催化L-精*酸合成NO的一類(lèi)酶,主要存在于血管平滑肌、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎小球膜細(xì)胞等各種細(xì)胞中。NO作為細(xì)胞信息分子,在神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

        NOS催化L-精*酸、分子氧和NADPH,生成NONADP+,NO在水溶液中極易氧化生成NO2-NO3-。在酸性條件下,NO2-與重氮鹽磺酸胺生成重氮化合物,進(jìn)一步與萘基乙烯基二胺偶合,產(chǎn)物在550nm處有特征吸收峰,測(cè)定其吸光值,可以計(jì)算得到NOS活性大小。

        注意:實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

        需自備的儀器和用品:

        可見(jiàn)分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、分析天平、1mL玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

        操作步驟:

        一、 樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn))

        1. 組織樣本:建議稱取0.2g樣本,加入0.98mL提取液一和0.02mL提取液二,冰浴勻漿后,于4℃,12000g,離心15min,棄沉淀,取上清液置于冰上待測(cè)。

        2. 細(xì)菌/細(xì)胞樣本:建議1000萬(wàn)細(xì)菌/細(xì)胞加入0.98mL提取液一和0.02mL提取液二,冰浴超聲破碎(功率200W,超聲3s,間隔7s,總時(shí)間5min),然后于4℃,12000g,離心15min,棄沉淀,取上清液置于冰上待測(cè)。

        3. 液體樣本:直接測(cè)定。若液體有渾濁則離心取上清測(cè)定。

        注:可根據(jù)樣本量將提取液一和提取液二按照0.98mL0.02mL的比例混勻后進(jìn)行樣本前處理。

        二、 測(cè)定步驟

        1.可見(jiàn)分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至550nm,蒸餾水調(diào)零。

        2.2mL EP管按下表順序加樣:

        試劑名稱(μL

        測(cè)定管

        標(biāo)準(zhǔn)管

        空白管

        樣本

        240

        -

        -

        工作液

        500

        -

        -

        混勻,37℃反應(yīng)60min,沸水浴5min(扣緊蓋子),冷卻后4℃,11000g離心10min,取全部上清于一個(gè)新EP管中

        -

        -

        上清液

        全部上清液

        -

        -

        試劑六

        40

        -

        -

        試劑七工作液

        40

        -

        -

        混勻,37℃反應(yīng)30min

        -

        -

        標(biāo)準(zhǔn)液

        -

        240

        -

        蒸餾水

        -

        580

        820

        顯色液

        400

        400

        400


         

         

        混勻,常溫靜置10min,取1mL反應(yīng)液于1mL玻璃比色皿中測(cè)定550nm處各管吸光值,分別記為A測(cè)定、A標(biāo)準(zhǔn)和A空白,計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A空白,ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白??瞻坠芎蜆?biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)1-2次。

        三、NOS活性計(jì)算

        1. 按樣本蛋白濃度計(jì)算

        單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NO定義為一個(gè)酶活單位。

        NOS活性(U/mg prot=ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn))×V÷Cpr×V樣)×103÷T×F=0.83×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr×F

        2. 按樣本質(zhì)量計(jì)算

        單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NO定義為一個(gè)酶活單位。

        NOS活性(U/g 質(zhì)量)=ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn))×V÷W×V÷V樣總)×103÷T×F

        =0.83×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F

        3. 按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)目計(jì)算

        單位的定義:每106個(gè)細(xì)菌/細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NO定義為一個(gè)酶活單位。

        NOS活性(U/106 cell=ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn))×V÷N×V÷V樣總)×103÷T×F

        =0.83×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N×F

        4. 按液體體積計(jì)算

        單位的定義:每mL液體每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NO定義為一個(gè)酶活單位。

        NOS活性(U/mL=ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn))×V÷V×103÷T×F=0.83×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×F

        C標(biāo)準(zhǔn):0.05μmol/mL;V樣:反應(yīng)體系中加入的樣本體積,0.24mL;V樣總:加入的提取液一和提取液二的總體積,1mL;Cpr:蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,gN:細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)目,以106計(jì);103:?jiǎn)挝粨Q算系數(shù),1μmol=103nmolT:反應(yīng)時(shí)間,60minF:樣本稀釋倍數(shù)。

        注意事項(xiàng):

        1. NOS穩(wěn)定性差,易變性失活,建議使用新鮮樣本實(shí)驗(yàn),如果不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn),樣本需-20℃保存。

        2. 試劑二配制好后,建議根據(jù)樣本量取出所需試劑二,剩余試劑二需盡快置于-20℃保存。

        3. 如果?A測(cè)定小于0.005或測(cè)定管吸光值接近空白管,可以增加樣本量或者延長(zhǎng)第一步37℃反應(yīng)時(shí)間后再進(jìn)行測(cè)定;如果?A測(cè)定大于0.4,建議將樣本勻漿后的上清液用緩沖液適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。注意同步修改計(jì)算公式。

        實(shí)驗(yàn)實(shí)例:

        1. 0.2075g新鮮小鼠腦組織樣本,加入0.98mL提取液一和0.02mL提取液二進(jìn)行冰浴勻漿,離心后取上清,按照測(cè)定步驟操作,用1mL玻璃比色皿測(cè)得計(jì)算:ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A空白=0.062-0.001=0.061,ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.386-0.001=0.385,按樣本質(zhì)量計(jì)算得:

        NOS活性(U/g 質(zhì)量)=0.83×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W = 0.634 U/g 質(zhì)量。

        2. 0.5×106個(gè)細(xì)胞K562,加入0.98mL提取液一和0.02mL提取液二進(jìn)行冰浴超聲破碎,離心后取上清,按照測(cè)定步驟操作,用1mL玻璃比色皿測(cè)得計(jì)算:ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A空白=0.086-0.001=0.085,ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.386-0.001=0.385,按樣本細(xì)胞數(shù)目計(jì)算得:

        NOS活性(U/106 cell=0.83×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N = 0.366 U/106 cell

         

        3. 240μL馬血清樣本,按照測(cè)定步驟操作,用1mL玻璃比色皿測(cè)得計(jì)算:ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A空白=0.043-0.001 =0.042,ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.386-0.001=0.385,按液體體積計(jì)算得:

        NOS活性(U/mL=0.83×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn) = 0.091 U/mL

        參考文獻(xiàn):

        [1] List BM, Kl?sch B, V?lker C. et al. Characterization of bovine endothelial nitric oxide synthase as a homodimer with down-regulated uncoupled NADPH oxidase activity: tetrahydrobiopterin binding kinetics and role of haem in dimerization[J]. Biochemical Journal, 1997, 323(1): 159-165.

        [2] Dawson J, Knowles RG. A microtiter-plate assay of nitric oxide synthase activity[J]. Molecular Biotechnology, 1999, 12(3): 275-279.

        [3] F?rstermann U, Sessa WC. Nitric oxide synthases: regulation and function[J]. European Heart Journal, 2012, 33(7): 829-837.

        相關(guān)系列產(chǎn)品:

        BC0080/BC0085 硝酸還原酶(NR)活性檢測(cè)試劑盒

        BC1470/BC1475 一氧化氮(NO)含量檢測(cè)試劑盒(酶法測(cè)定總NO

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