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        • 一氧化氮合成酶活性檢測試劑盒 微量法
        產(chǎn)品名稱:

        一氧化氮合成酶活性檢測試劑盒 微量法

        產(chǎn)品品牌: SOLARBIO/索萊寶 價格:
        廠商性質(zhì): 生產(chǎn)廠家 產(chǎn)品時間: 2024-04-23
        有效期
        6個月
        儲存條件
        -20℃
        中文名稱
        一氧化氮合成酶活性檢測試劑盒 微量法
        單位

        英文名稱
        Nitric Oxide Synthase (NOS) Activity Assay kit
        檢測方法
        微量法
        規(guī)格
        100T/96S

        產(chǎn)品概述

        品牌SOLARBIO/索萊寶CAS詳詢
        分子式詳詢純度詳詢
        分子量詳詢貨號BC5685
        規(guī)格100T/96S供貨周期現(xiàn)貨
        主要用途一氧化氮合成酶(NOS)活性檢測應(yīng)用領(lǐng)域環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,綜合

        一氧化氮合成酶(NOS)活性檢測試劑盒說明書

        微量法

        貨號:BC5685

        規(guī)格:100T/96S

        產(chǎn)品組成:使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

        試劑名稱

        規(guī)格

        保存條件

        提取液一

        液體110 mL×1

        -20℃保存

        提取液二

        液體0.6 mL×4

        -20℃保存

        緩沖液

        液體15 mL×1

        2-8℃保存

        試劑一

        液體4 mL×1

        2-8℃保存

        試劑二

        粉劑×1

        -20℃保存

        試劑三

        液體30 μL×1

        2-8℃保存

        試劑四

        粉劑×1

        -20℃保存

        試劑五

        粉劑×1

        -20℃保存

        試劑六

        液體1.5 mL×1

        2-8℃保存

        試劑七

        液體30 μL×1

        2-8℃保存

        顯色液A

        液體6 mL×1

        2-8℃保存

        顯色液B

        液體6 mL×1

        2-8℃保存

        標(biāo)準品

        液體1 mL×1

        2-8℃保存

        溶液的配制:

        1. 提取液二:為易揮發(fā)試劑,用完后盡快密封,-20℃保存;

        1. 試劑二:試劑放于瓶內(nèi)玻璃瓶中,臨用前加入6mL緩沖液,-20℃分裝可保存4周,避免反復(fù)凍融;

        2. 試劑三工作液:臨用前根據(jù)樣本量按照試劑三:緩沖液=2μL198μL200μL,10T)的比例配制,現(xiàn)用現(xiàn)配;

        3. 試劑四:臨用前加入0.6mL緩沖液,-20℃分裝可保存4周,避免反復(fù)凍融;

        4. 試劑五:試劑放于瓶內(nèi)玻璃瓶中,臨用前加入2.4mL緩沖液,-20℃分裝可保存4周,避免反復(fù)凍融;

        5. 工作液:臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照試劑一:試劑二:試劑三工作液:試劑四:試劑五=0.3mL0.5mL0.2mL0.05mL0.2mL1.25mL,10T)的比例配制工作液,現(xiàn)用現(xiàn)配;

        6. 試劑七工作液:臨用前根據(jù)樣本量按照試劑七:緩沖液=5μL225μL0.23mL,23T)的比例配制,現(xiàn)用現(xiàn)配;

        7. 顯色液:臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照顯色液A液:顯色液B=1:1充分混勻,現(xiàn)配現(xiàn)用;

        8. 標(biāo)準品:10μmol/mL亞*酸鈉。臨用前取10μL 10μmol/mL亞*酸鈉標(biāo)準液,加入990μL蒸餾水,配制成0.1μmol/mL亞*酸鈉標(biāo)準液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

        產(chǎn)品說明:

        一氧化氮合成酶(Nitric Oxide Synthase,NOS,EC 1.14.13.39)是生物體內(nèi)催化L-精*酸合成NO的一類酶,主要存在于血管平滑肌、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞、肝細胞、腎小球膜細胞等各種細胞中。NO作為細胞信息分子,在神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

         

        NOS催化L-精*酸、分子氧和NADPH,生成NONADP+,NO在水溶液中極易氧化生成NO2-NO3-。在酸性條件下,NO2-與重氮鹽磺酸胺生成重氮化合物,進一步與萘基乙烯基二胺偶合,產(chǎn)物在550nm處有特征吸收峰,測定其吸光值,可以計算得到NOS活性大小。

        注意:實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

        需自備的儀器和用品:

        可見分光光度計/酶標(biāo)儀、低溫離心機、分析天平、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

        操作步驟:

        一、 樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,具體比例可以參考文獻)

        1. 組織樣本:建議稱取0.2g樣本,加入0.98mL提取液一和0.02mL提取液二,冰浴勻漿后,于4℃,12000g,離心15min,棄沉淀,取上清液置于冰上待測。

        2. 細菌/細胞樣本:建議1000細菌/細胞加入0.98mL提取液一和0.02mL提取液二,冰浴超聲破碎(功率200W,超聲3s,間隔7s,總時間5min),然后于4℃,12000g,離心15min,棄沉淀,取上清液置于冰上待測。

        3. 液體樣本:直接測定。若液體有渾濁則離心取上清測定。

        注:可根據(jù)樣本量將提取液一和提取液二按照0.98mL0.02mL的比例混勻后進行樣本前處理。

        二、 測定步驟

        1.可見分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至550nm,分光光度計蒸餾水調(diào)零。

        2.1.5mL EP管按下表順序加樣:

        試劑名稱(μL

        測定管

        標(biāo)準管

        空白管

        樣本

        60

        -

        -

        工作液

        125

        -

        -

        混勻,37℃反應(yīng)60min,沸水浴5min(扣緊蓋子),冷卻后4℃11000g離心10min,取全部上清于一個新EP管中

        -

        -

        上清液

        全部上清液

        -

        -

        試劑六

        10

        -

        -

        試劑七工作液

        10

        -

        -

        混勻,37℃反應(yīng)30min

        -

        -

        標(biāo)準液

        -

        60

        -

        蒸餾水

        -

        145

        205

        顯色液

        100

        100

        100

        混勻,常溫靜置10min,取200μL反應(yīng)液于96孔板中測定550nm處各管吸光值,分別記為A測定、A標(biāo)準和A空白,計算ΔA測定=A測定-A空白,ΔA標(biāo)準=A標(biāo)準-A空白??瞻坠芎蜆?biāo)準管只需測1-2次。

         

         

         

         

        三、NOS活性計算

        1. 按樣本蛋白濃度計算

        單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NO定義為一個酶活單位。

        NOS活性(U/mg prot=ΔA測定÷ΔA標(biāo)準×C標(biāo)準)×V÷Cpr×V樣)×103÷T×F=1.67×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準÷Cpr×F

        2. 按樣本質(zhì)量計算

        單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NO定義為一個酶活單位。

        NOS活性(U/g 質(zhì)量)=ΔA測定÷ΔA標(biāo)準×C標(biāo)準)×V÷W×V÷V樣總)×103÷T×F

        =1.67×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準÷W×F

        3. 按細菌/細胞數(shù)目計算

        單位的定義:每106個細菌/細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NO定義為一個酶活單位。

        NOS活性(U/106 cell=ΔA測定÷ΔA標(biāo)準×C標(biāo)準)×V÷N×V÷V樣總)×103÷T×F

        =1.67×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準÷N×F

        4. 按液體體積計算

        單位的定義:每mL液體每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NO定義為一個酶活單位。

        NOS活性(U/mL=ΔA測定÷ΔA標(biāo)準×C標(biāo)準)×V÷V×103÷T×F=1.67×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準×F

        C標(biāo)準:0.1μmol/mLV樣:反應(yīng)體系中加入的樣本體積,0.06mL;V樣總:加入的提取液一和提取液二的總體積,1mLCpr:蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,gN:細胞或細菌數(shù)目,以106計;103:單位換算系數(shù),1μmol=103nmol;T:反應(yīng)時間,60min;F:樣本稀釋倍數(shù)。

        注意事項:

        1. NOS穩(wěn)定性差,易變性失活,建議使用新鮮樣本實驗,如果不立即實驗,樣本需-20℃保存。

        2. 試劑二配制好后,建議根據(jù)樣本量取出所需試劑二,剩余試劑二需盡快置于-20℃保存。

        3. 如果?A測定小于0.005或測定管吸光值接近空白管,可以增加樣本量或者延長第一步37℃反應(yīng)時間后再進行測定;如果?A測定大于0.5,建議將樣本勻漿后的上清液用緩沖液適當(dāng)稀釋后再進行測定。注意同步修改計算公式。

        實驗實例:

        1. 0.2075g新鮮小鼠腦組織樣本,加入0.98mL提取液一和0.02mL提取液二進行冰浴勻漿,離心后取上清,按照測定步驟操作,用96孔板測得計算:ΔA測定=A測定-A空白=0.087-0.046=0.041,ΔA標(biāo)準=A標(biāo)準-A空白=0.519- 0.046=0.473,按樣本質(zhì)量計算得:

        NOS活性(U/g 質(zhì)量)=1.67×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準÷W = 0.698 U/g 質(zhì)量。

        2. 0.5×106個細胞K562,加入0.98mL提取液一和0.02mL提取液二進行冰浴超聲破碎,離心后取上清,按照測定步驟操作,用96孔板測得計算:ΔA測定=A測定-A空白=0.099-0.046=0.053ΔA標(biāo)準=A標(biāo)準-A空白=0.519- 0.046=0.473,按樣本細胞數(shù)目計算得:

        NOS活性(U/106 cell=1.67×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準÷N = 0.374 U/106 cell

        3. 60μL馬血清樣本,按照測定步驟操作,用96孔板測得計算:ΔA測定=A測定-A空白=0.069-0.046=0.023,ΔA標(biāo)準=A標(biāo)準-A空白=0.519-0.046=0.473,按液體體積計算得:

         

        NOS活性(U/mL=1.67×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準 = 0.081 U/mL

        參考文獻:

        [1] List BM, Kl?sch B, V?lker C. et al. Characterization of bovine endothelial nitric oxide synthase as a homodimer with down-regulated uncoupled NADPH oxidase activity: tetrahydrobiopterin binding kinetics and role of haem in dimerization[J]. Biochemical Journal, 1997, 323(1): 159-165.

        [2] Dawson J, Knowles RG. A microtiter-plate assay of nitric oxide synthase activity[J]. Molecular Biotechnology, 1999, 12(3): 275-279.

        [3] F?rstermann U, Sessa WC. Nitric oxide synthases: regulation and function[J]. European Heart Journal, 2012, 33(7): 829-837.

        相關(guān)系列產(chǎn)品:

        BC0080/BC0085 硝酸還原酶(NR)活性檢測試劑盒

        BC1470/BC1475 一氧化氮(NO)含量檢測試劑盒(酶法測定總NO

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