土壤酸性木聚糖酶（S-ACX）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

微量法

貨號(hào)：BC5725

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的配制：臨用前按緩沖液：試劑一= 4mL：2mL（6mL，約一條標(biāo)曲稀釋用量）的比例進(jìn)行配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2、 標(biāo)準(zhǔn)品：10mg木糖。臨用前加入667μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液配制成100μmol/mL的木糖標(biāo)準(zhǔn)液，2-8℃保存8周。

產(chǎn)品說(shuō)明：

土壤酸性木聚糖酶（Soil acid xylanase, S-ACX），又稱為土壤酸性半纖維素酶，主要分離自最適生長(zhǎng)pH為4-5的微生物在酸性環(huán)境中，S-ACX催化木聚糖降解成還原性寡糖和單糖，在沸水浴條件下進(jìn)一步與3,5-二硝基水楊酸發(fā)生顯色反應(yīng)，在540nm處有特征吸收峰，反應(yīng)液顏色的深淺與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)液在540nm吸光值增加速率，可計(jì)算S-ACX活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、天平、低溫離心機(jī)、水浴鍋、研缽、30~50目篩、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

新鮮土樣自然風(fēng)干或37℃烘箱風(fēng)干，過(guò)30~50目篩。

二、測(cè)定步驟

1、 可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至540nm，分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

2、 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：臨用前將標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋為2、1.5、1.2、1、0.8、0.4、0.2μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋表：

備注：實(shí)驗(yàn)中每管需要150μL。

4、 樣本測(cè)定（在EP管中加入下列試劑）

三、S-ACX計(jì)算公式

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA測(cè)定（y，ΔA測(cè)定）帶入公式計(jì)算樣本濃度（x，μmol/mL）。

2. 土壤S-ACX活性計(jì)算：

酶活定義：50℃，pH 4.8條件下，每克土壤每小時(shí)分解木聚糖產(chǎn)生1μmol還原糖所需的酶量為一個(gè)酸性木聚糖酶的活性單位。

S-ACX活性（U/g 土樣）=x× V反總÷W÷T×F=0.15×x÷W×F

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.3mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，2h；F：稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1. 若樣本ΔA<0.01，可適當(dāng)增大樣本量或者50℃反應(yīng)時(shí)間后測(cè)定；若樣本ΔA>1.5或者A測(cè)定＞1.5時(shí)，可用蒸餾水稀釋上清液后測(cè)定，注意同步修改計(jì)算公式中的稀釋倍數(shù)。

2. 建議使用螺旋管，防止沸水浴過(guò)程中蓋子爆開(kāi)，改變反應(yīng)體系。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.05g野蘑菇土樣，按操作表進(jìn)行第一步反應(yīng)2h后，取上清液用蒸餾水稀釋2倍后按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得ΔA測(cè)定=A測(cè)定- A對(duì)照=0.431-0.099=0.332，帶入標(biāo)曲y=0.6582x-0.153 （R²=0.999），計(jì)算x=0.737，按樣本質(zhì)量計(jì)算S-ACX活性得：

S-ACX活性（U/g 土樣）=0.15×x÷W×F =4.422 U/g 土樣。

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