碳酸酐酶活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC5445

規(guī)格：100T/96S

產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：試劑放于試劑瓶內玻璃瓶中。臨用前取一支試劑二，加入200μL丙酮充分震蕩溶解，-20℃可以分裝保存1周，避免反復凍融。

2、 試劑二工作液：臨用前按試劑二：蒸餾水=20μL：480μL（12T）的比例進行混合配制成試劑二工作液，現用現配，用多少配多少。 

3、 標準品：5μmol/mL 酚標準液。臨用前取100μL的5μmol/mL 酚標準液于EP管中，加入700μL蒸餾水充分混合，配制成0.625 μmol/mL的酚標準液。 

產品說明：

碳酸酐酶（Carbonic Anhydrase, CA, EC4.2.1.1）是一種以Zn²⁺為活性中心的金屬酶，可用來高效催化CO₂的可逆水合反應：CO₂+H₂O?HCO₃^-+H⁺，催化速率可達自然條件下的10⁷倍，是目前已知催化速率最快的酶之一。

碳酸酐酶可催化乙酸對硝基苯酯反應生成對硝基苯*，通過檢測405nm處吸光值上升速率反映碳酸酐酶活性。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、臺式離心機、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、蒸餾水和冰。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復30次），8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、液體：直接測定。(若溶液呈現渾濁，則離心取上清后再測定)。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至405nm，可見分光光度計用蒸餾水調零。

2、 標準管測定

（1） 標準管的測定：在微量玻璃比色皿/96孔板加入20μL標準液，180μL試劑一，充分混勻后于405nm處測定吸光值，記作A_標準。

（2） 標準空白管的測定：在微量玻璃比色皿/96孔板加入20μL蒸餾水，180μL試劑一，充分混勻后于405nm處測定吸光值，記作A_標準空白。

（3） 計算?A_標準=A_標準-A_標準空白。（標準管和標準空白管只需做1-2次。）

3、 操作表：（在微量玻璃比色皿或者96孔板內依次加入下列試劑）

按照加樣表依次在微量玻璃比色皿/96孔板加入上述試劑，充分混勻后于405nm處測定10s時的吸光值A1，迅速置于37℃水浴或恒溫培養(yǎng)箱5min（酶標儀有控溫功能可將溫度調至37℃），拿出迅速擦干測定5min10s時的吸光值A2。計算A_測定=A2_測定-A1_測定，A_空白=A2_空白-A1_空白，?A =A_測定-A_空白。（空白管只需做1-2次。）

三、CA活性計算

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：37℃，每mg組織蛋白每分鐘催化產生1μmol 對硝基*酚定義為一個酶活力單位。

CA活性（U/mg prot）= C_標×?A÷?A_標準×V_樣÷（V_樣×Cpr）÷T×F=0.125×?A÷?A_標準÷Cpr ×F

(2) 按樣本質量計算

單位的定義：37℃，每g組織每分鐘催化產生1μmol 對硝基*定義為一個酶活力單位。

CA活性（U/g 質量）= C_標×?A÷?A_標準×V_樣÷（V_樣÷V_樣總×W ）÷T×F=0.125×?A÷?A_標準÷W×F

(3) 按液體體積計算

單位的定義：每mL液體每分鐘催化產生1μmol 對硝基酚定義為一個酶活力單位。

CA活性（U/mL）= C_標×?A÷?A_標準× V_樣÷V_樣÷T×F=0苯.125×?A÷?A_標準×F

C_標：標準品濃度，0.625μmol/mL；V_樣：反應體系中加入的樣本體積，0.02mL；V_樣總：加入的提取液體積，1mL；T：反應時間，5min；Cpr：蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g； F：樣本稀釋倍數。

注意事項：

如果A1測定大于0.5或者?A大于1，可以用蒸餾水對樣本進行稀釋或者縮短37℃酶促反應時間；?A小于0.02，可以加大樣本量或者延長37℃酶促反應時間。注意計算時同步修改計算公式。

實驗實例：

1、 稱取0.1029g小鼠肝臟組織，加入提取液進行冰浴勻漿，離心后取上清，將上清稀釋40倍后，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算A_測定=A2_測定-A1_測定=0.809-0.182=0.627，A_空白=A2_空白-A1_空白=0.155-0.115=0.040，?A =A_測定-A_空白=0.587，?A_標準=A_標準-A_標準空白=0.627-0.047=0.58，帶入公式計算：

CA活性（U/g 質量）=0.125×?A÷?A_標準÷W×F =49.177 U/g 質量

2、 稱取0.1058g娃娃菜葉片組織，加入提取液進行冰浴勻漿，離心后取上清，用蒸餾水稀釋2倍后按照測定步驟操作，用96孔板測得計算A_測定=A2_測定-A1_測定=0.408-0.155=0.253，A_空白=A2_空白-A1_空白=0.155-0.115=0.040，?A =A_測定-A_空白=0.213，?A_標準=A_標準-A_標準空白=0.627-0.047=0.58，帶入公式計算：

CA活性（U/g 質量）=0.125×?A÷?A_標準÷W×F =0.868 U/g 質量

3、 吸取20μL兔血清，稀釋2倍后，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算A_測定=A2_測定-A1_測定=1.097-0.251=0.846，A_空白=A2_空白-A1_空白=0.155-0.115=0.040，?A =A_測定-A_空白=0.806，?A_標準=A_標準-A_標準空白=0.627-0.047=0.58，帶入公式計算： 

CA活性（U/mL）=0.125×?A÷?A_標準×F =0.347 U/mL

參考文獻：

[1] BROWNELL, P. F, BIELIG, et al. Increased Carbonic Anhydrase Activity in Leaves of Sodium-Deficient C4 Plants[J]. Functional Plant Biology, 1991, 18(6):589-592.

[2] A, V. Tavallali , et al. Zinc influence and salt stress on photosynthesis, water relations, and carbonic anhydrase activity in pistachio. Scientia Horticulturae, 2009, 123(2): 272-279.

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