L-乳酸（L-LA）含量檢測試劑盒（WST顯色法）說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC5345

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前按試劑二（V）：蒸餾水（V）=10μL：450μL（46T）的比例配制試劑二溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配；

2、 試劑三：臨用前每瓶加入3 mL 蒸餾水混勻，可分裝后-20℃保存4周，避免反復凍融；

3、 標準品：臨用前加入1.04 mL蒸餾水配成100 μmol/mL 的標準溶液，2-8℃可保存12周；

產(chǎn)品說明：

乳酸是生物體代謝過程中重要的中間產(chǎn)物，與糖代謝、脂類代謝、蛋白質代謝及細胞內能量代謝密切相關，乳酸含量是評估糖元代謝的和有氧代謝的重要指標。乳酸在乳酸脫氫酶的作用下生成丙酮酸，同時使NAD⁺還原生成NADH和H⁺，在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH反應，產(chǎn)生水溶性formazan，其在450nm處有最大吸收峰，據(jù)此可計算乳酸含量。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

分析天平、研缽/勻漿器/超聲波細胞破碎儀、離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、水

浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、蒸餾水。 

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織：按照質量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

2. 細胞或細菌：按照細胞/細菌數(shù)量（10⁴個）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞/細菌加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細胞/細菌（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

3. 血清（漿）等液體：取100μL液體加入1mL提取液一，4℃ 12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

注：提取液二需緩慢加入，加入后會產(chǎn)生大量氣泡，建議使用2mL EP管進行操作。

二、 測定步驟

1、分光光度計/酶標儀預熱30min以上，波長調至450nm，分光光度計用蒸餾水調零。

2、 標準液的稀釋：將100μmol/mL的標準溶液用蒸餾水稀釋為1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.020μmol/mL的標準溶液備用。

3、標準品稀釋表：

實驗中每個標準管需10µL標準溶液

3、加樣表：（按順序將下列試劑加在96孔板/EP管中）

混勻后，于450nm處測定吸光值，分別記為A測定管，A對照管，A標準管，A空白管，計算ΔA測定=A測定管-A對照管；ΔA標準= A標準管-A空白管。每個測定管需設置一個對照管，空白管和標準曲線只需測定1-2次。

三、 乳酸含量的計算

1、標準曲線的繪制

以各標準溶液濃度為x軸，以其對應的吸光值（ΔA標準）為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程y=kx+b，將ΔA測定帶入公式中得到x（μmol/mL）。

2、乳酸含量計算

（1）按照樣本蛋白濃度計算

LA含量（μmol/mg prot）=x×V樣本÷（V樣本×Cpr）= x÷Cpr

（2）按照樣本質量計算

LA含量（μmol/g 質量）=x×（V上清+V提取液二）÷ （W×V上清÷V提取液一）=1.1875×x÷W

（3）按照細胞/細菌數(shù)量計算

LA含量（μmol/10⁴ cell）=x×（V上清+V提取液二）÷ （N×V上清÷V提取液一）=1.1875×x÷N

（4）按照液體體積計算

LA含量（μmol/mL）=x×（V上清+V提取液二）÷ [V液體×V上清÷（V提取液一+V液體）]=13.0625×x

V樣本：加入的樣本體積，0.01mL；W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL，蛋白濃度需自行測定；V上清：提取時上清液體積，0.8mL；V提取液二：加入提取液二的體積，0.15mL；V提取液一：加入的提取

液一體積，1mL；N：細胞/細菌數(shù)量，10⁴個；V液體：液體樣本體積，0.1mL。

注意事項：

1. ΔA測定的測定范圍在0.01-1.1之間。如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以用蒸餾水稀釋樣本后再次測定，如果測定吸光值小于線性范圍吸光值，需要增加樣本量后再次測定，注意同步計算公式。

2. 提取液一中含有蛋白質沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測定。如需測定蛋白含量，需另取組織。

實驗實例：

1、 取0.1466g小鼠肝加入1mL提取液一，冰浴勻漿后離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清后用蒸餾水稀釋兩倍，按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.573-0.091=0.482，根據(jù)標準曲線y=0.8941x+0.0016，R²=0.9991，計算x=0.5373，按樣本質量計算含量得：

LA含量（μmol/g 質量）= 1.1875×x÷W×稀釋倍數(shù)=1.1875×0.5373÷0.1466×2=8.7046 μmol/g質量。

2、 取0.1063g紅薯根加入1mL提取液一，冰浴勻漿后離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清，之后按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.128-0.105=0.023，根據(jù)標準曲線y=0.8941x+0.0016，R²=0.9991，計算x=0.0239，按樣本質量計算含量得：

LA含量（μmol/g 質量）=1.1875×x÷W=1.1875×0.0239÷0.1063=0.2674 μmol/g質量。

3、 取100μL羊血清加入1mL提取液一，離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清，之后按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.424-0.104=0.320，根據(jù)標準曲線y=0.8941x+0.0016，R²=0.9991，計算x=0.3561，按照液體體積計算含量得：

LA含量（μmol/mL）=13.0625×x=13.0625×0.3561=4.6517 μmol/mL。

參考文獻：

Eolbergrová J, MacMillan V, Siesj? B K. The effect of moderate and marked hypercapnia upon the energy state and upon the cytoplasmic NADH/NAD⁺ ratio of the rat brain[J]. Journal of neurochemistry, 1972, 19(11): 2497-2505.

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