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        • 吡咯啉-5-羧酸還原酶活性檢測試劑盒 其它
        產品名稱:

        吡咯啉-5-羧酸還原酶活性檢測試劑盒 其它

        產品品牌: SOLARBIO/索萊寶 價格:
        廠商性質: 生產廠家 產品時間: 2024-04-19
        吡咯啉-5-羧酸還原酶活性檢測試劑盒 其它
        有效期
        6個月
        儲存條件
        -20℃
        單位

        英文名稱
        Pyrroline-5-Carboxylate Reductase(P5CR)Activity Assay Kit
        檢測方法
        可見分光光度法 Spectrophotometer
        規(guī)格
        50T/24S

        產品概述

        品牌SOLARBIO/索萊寶CAS詳詢
        分子式詳詢純度詳詢
        分子量詳詢貨號BC5380
        規(guī)格50T/24S供貨周期現(xiàn)貨
        主要用途吡咯啉-5-羧酸還原酶活性檢測應用領域環(huán)保,化工,生物產業(yè),農林牧漁,綜合

        吡咯啉-5-羧酸還原酶(P5CR)活性檢測試劑盒說明書

        可見分光光度法

        貨號:BC5380

        規(guī)格:50T/24S

        產品內容:使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致,有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

        試劑名稱

        規(guī)格

        保存條件

        提取液一

        液體30 mL×1

        2-8℃保存

        提取液二

        液體300μL×1

        -20℃保存

        試劑一

        液體15mL×1

        2-8℃保存

        試劑二

        液體30mL×1

        2-8℃保存

        試劑三

        粉劑×1

        -20℃保存

        試劑四

        液體8mL×1

        2-8℃保存

        標準品

        粉劑×1

        -20℃保存

        溶液的配制:

        1、 提取液二:易揮發(fā)試劑,用完后盡快封口放回-20℃保存。

        2、 提取液的配制:根據樣本量按提取液一:提取液二=0.99mL0.01mL1T)的比例配制提取液,現(xiàn)用現(xiàn)配,禁止提前配制。

        3、 試劑三:臨用前加入14mL試劑一,充分混勻。未用完的試劑分裝保存,-20℃保存可以保存4周,避免反復凍融。

        4、 標準品:臨用前加入 1.4 mL 蒸餾水,即 2 µmol/mL NADH標準液,未用完的試劑分裝保存,-20℃可以保存2周,避免反復凍融。臨用前取50μL2 µmol/mL NADH標準液EP管中,加入750μL蒸餾水充分溶解,配制成0.125μmol/mLNADH標準溶液待用,現(xiàn)用現(xiàn)配。

        產品說明:

        吡咯啉-5-羧酸還原酶(pyrroline-5-carboxylate reductase,P5CR)是廣泛存在于原核和真核生物中的一種重要的管家蛋白。在NAD(P)H的作用下,吡咯啉-5-羧酸(P5C)在吡咯啉-5-羧酸還原酶作用下轉化為脯*酸,并且P5CR 還被發(fā)現(xiàn)能夠在大腸桿菌中參與到硫代脯*酸(Thioproline) 的代謝過程。

        硫代脯*酸在吡咯啉-5-羧酸還原酶催化作用下脫氫,并伴隨著NAD轉化為NADH。在1-mPMS作用下,WST-1可與NADH 反應,產生水溶性formazan,在450nm下有特征吸收峰。


        注意:實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

        需自備的儀器和用品:

         

         

        可見分光光度計、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調式移液器、分析天平、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、1mL玻璃比色皿、蒸餾水和冰。

        操作步驟:

        一、樣本處理(可適當調整待測樣本量,具體比例可以參考文獻)

        1、組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

        2、細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

        3、血清(漿)等液體:直接測定。(若溶液呈現(xiàn)渾濁,則離心取上清后再測定)。

        二、測定步驟

        1、 可見分光光度計預熱30min以上,調節(jié)波長至450nm,蒸餾水調零。

        2、操作表:

        試劑名稱(μL

        測定管

        對照管

        標準管

        空白管

        試劑二

        450

        450

        450

        450

        試劑三

        450

        -

        -

        -

        蒸餾水

        -

        450

        450

        550

        試劑四

        100

        100

        100

        100

        標準溶液

        -

        -

        100

        -

        樣品

        100

        100

        -

        -

        充分混勻,37℃反應顯色30min,取1000μL1mL玻璃比色皿中,測定在450nm處的吸光度。記作A測定,A對照,A標準,A空白?A測定=A測定-A對照,?A標準=A標準-A空白。(標準管和空白管只需做1-2次。)

        三、P5CR活性計算

        (1) 按樣本蛋白濃度計算

        單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產生1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

        P5CR活性(U/mg prot=(?A測定×C標準÷?A標準) ×V ÷Cpr×V÷T×103×F=4.167×?測定÷?標準÷Cpr×F

        (2) 按樣本質量計算

        單位的定義:每g組織每分鐘催化產生1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

        P5CR活性(U/g 質量)= (?A測定×C標準÷?A標準) ×V ÷W÷V樣總×V÷T×103×F=4.167×?測定÷?標準÷W×F

        (3) 按細菌或細胞數(shù)目計算

        單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

        P5CR活性(U/104 cell= (?A測定×C標準÷?A標準) ×V ÷500÷V樣總×V÷T×103×F=0.0083×?測定÷?標準×F

        (4) 按血清(漿)等液體體積計算

        單位的定義:每mL血清(漿)等液體每分鐘催化產生1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

        P5CR活性(U/mL= (?A測定×C標準÷?A標準) ×V÷V÷T×103×F=4.167×?測定÷?標準×F

        C標準: NADH標準液的濃度,0.125μmol/mL;V:反應體系中加入的樣本體積,0.1mL;V樣總:加入的提取液體積,1mL;T:反應時間,30min;Cpr:蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g

         

         

         

        500:細胞或細菌數(shù)目,500萬;103:單位換算系數(shù),1μmol/mL=103nmol/mL;F:樣本稀釋倍數(shù)。

        注意事項:

        1. 如果A測定大于1.5或者?A測定大于0.8,可以減少樣品量或者縮短反應時間;若?A測定小于0.01,可以加大樣品量或者延長反應時間至1h或者更長時間。計算公式注意同步修改

        實驗實例:

        1、 稱取0.0993g橙子葉片,加入提取液進行冰浴勻漿按照測定步驟操作,用1mL玻璃比色皿測得計算?A測定=A測定-A對照=0.413-0.324=0.089,?A標準=A標準- A空白=0.609-0.363=0.246,帶入公式計算:

        P5CR活性(U/g 質量)= 4.167×?測定÷?標準÷W×F =4.167×0.089÷0.246÷0.0993=15.182 U/g

        2、 稱取0.1006g小鼠腎臟組織,加入提取液進行冰浴勻漿,按照測定步驟操作,用1mL玻璃比色皿測得計算?A測定=A測定-A對照=0.543-0.461=0.082,?A標準=A標準- A空白=0.609-0.363=0.246,帶入公式計算:

        P5CR活性(U/g 質量)= 4.167×?測定÷?標準÷W×F =4.167×0.082÷0.246÷1.006=13.807U/g

        3、 吸取0.02mL羊血清,按照測定步驟操作,用1mL玻璃比色皿測得計算?A測定=A測定-A對照=0.616-0.215=0.401?A標準=A標準- A空白=0.609-0.363=0.246,帶入公式計算: 

        P5CR活性(U/mL)= 4.167×?測定÷?標準×F =4.167×0.401÷0.246=6.793U/mL

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