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        • 谷*酰胺(Gln)含量檢測(cè)試劑盒
        產(chǎn)品名稱:

        谷*酰胺(Gln)含量檢測(cè)試劑盒

        產(chǎn)品品牌: SOLARBIO/索萊寶 價(jià)格:
        廠商性質(zhì): 生產(chǎn)廠家 產(chǎn)品時(shí)間: 2024-04-19
        谷*酰胺(Gln)含量檢測(cè)試劑盒
        儲(chǔ)存條件
        -20℃
        有效期
        6個(gè)月
        單位

        英文名稱
        Glutamine (Gln) Content Assay Kit
        檢測(cè)方法
        微量法 Spectrophotometer/Microplate Reader
        規(guī)格
        100T/48S
        自備試劑
        該試劑盒實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需自備試劑,詳情見(jiàn)網(wǎng)站說(shuō)明書(shū)

        產(chǎn)品概述

        品牌SOLARBIO/索萊寶CAS詳詢
        分子式詳詢純度詳詢
        分子量詳詢貨號(hào)BC5305
        規(guī)格100T/48S供貨周期現(xiàn)貨
        主要用途谷*酰胺(Gln)含量檢測(cè)應(yīng)用領(lǐng)域環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,綜合

        谷*酰胺(Gln)含量檢測(cè)試劑盒

        微量法

        貨號(hào):BC5305

        規(guī)格:100T/48S

        產(chǎn)品內(nèi)容:使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致,有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

        試劑名稱

        規(guī)格

        保存條件

        提取液一

        液體80mL×1

        2-8℃保存

        提取液二

        液體30mL×1瓶(自備)

        2-8℃保存

        試劑一

        液體2mL×1

        2-8℃保存

        試劑二

        粉劑×1

        -20℃保存

        試劑三

        液體5mL×1

        2-8℃保存

        試劑四

        粉劑×1

        -20℃保存

        試劑五

        粉劑×1

        -20℃保存

        試劑六

        液體4mL×1

        2-8℃保存

        標(biāo)準(zhǔn)

        液體1mL×1

        2-8℃保存

        溶液的配制:

        1. 提取液二:氯仿,需自備。

        2. 試劑二:試劑質(zhì)量很小,有可能肉眼觀察不到,直接使用即可。臨用前取一支加入0.2mL蒸餾水,-20℃分裝可保存4周,避免反復(fù)凍融。

        3. 試劑二工作液:根據(jù)樣本量按試劑二:蒸餾水=0.05mL0.7mL(約18S)的比例進(jìn)行稀釋,現(xiàn)用現(xiàn)配,使用時(shí)置于冰上

        4. 試劑四:臨用前加入20mL提取液一,用不完的試劑分裝-20℃保存4周。避免反復(fù)凍融。

        5. 試劑五:臨用前加入1.5mL試劑一,用不完的試劑分裝后-20℃保存4周。避免反復(fù)凍融,使用時(shí)置于冰上。

        6. 標(biāo)準(zhǔn)品:10μmol/mL谷*酰胺標(biāo)準(zhǔn)液。

        產(chǎn)品說(shuō)明:

        谷*酰胺(Glutamine)簡(jiǎn)稱Gln,是谷*酸的酰胺,是組成蛋白質(zhì)的重要氨基酸之一。同時(shí)谷*酰胺也是三羧酸循環(huán)中α-酮戊二酸的主要來(lái)源。谷*酰胺在生物體內(nèi)以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種狀態(tài)存在,游離的谷*酰胺是在生物體代謝中起著重要作用,其代謝占細(xì)胞和血液循環(huán)中自由氨基酸的60%以上。

        游離谷*酰胺在谷*酰胺酶的催化作用下轉(zhuǎn)變?yōu)楣?酸,谷*酸脫氫酶(GDH)催化谷*酸和NAD生成α-酮戊二酸、NADHNH4+,在1-mPMS作用下,WST可與NADH反應(yīng),產(chǎn)生水溶性formazan,其在450nm處有最大吸收峰,據(jù)此可計(jì)算谷*酰胺含量。

         

        注意:實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。 

        需自備的儀器和用品:

        酶標(biāo)儀/可見(jiàn)分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、氯仿、96孔板/微量玻璃比色皿、冰和蒸餾水。

        操作步驟:

        一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn))

        1. 組織:按照樣本質(zhì)量(g):提取液一體積(mL)為1:5~10 的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液一)加入提取液一,冰浴勻漿;12000g 4℃離心5min,取上清加入500µL提取液二,劇烈振蕩5min,12000g 4℃離心5min,取上層液體(呈清澈狀態(tài))置冰上待測(cè)(中層渾濁物質(zhì)和下層液體不需要)。

        2. 細(xì)菌或細(xì)胞樣本:收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液一體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液一)加入提取液一,超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(溫度4℃,功率200W,超聲 3s,間隔 7s,總時(shí)間3min),12000g 4℃離心5min,取上清加入500µL提取液二,劇烈振蕩5min,12000g 4℃離心5min,取上層液體(呈清澈狀態(tài))置冰上待測(cè)(中層渾濁物質(zhì)和下層液體不需要)。

        3. 血清(漿)等液體樣本:取500µL樣本加入500µL提取液二(若溶液渾濁則需先離心后取上清),劇烈振蕩5min,12000g 4℃離心5min,取上層液體(呈清澈狀態(tài))置冰上待測(cè)(中層渾濁物質(zhì)和下層液體不需要)。

        注:如果需要測(cè)蛋白濃度,需在加提取液二之前測(cè)定蛋白濃度。

        二、測(cè)定步驟

        1、酶標(biāo)儀/可見(jiàn)分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至450nm,可見(jiàn)分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

        2、0.4μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋:取40μL 10μmol/mL谷*酰胺標(biāo)準(zhǔn)液,加入960μL蒸餾水,充分混勻,配制成0.4μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液使用,現(xiàn)用現(xiàn)配。(實(shí)驗(yàn)中每管需要40μL,為減小實(shí)驗(yàn)誤差,故配制大體積。)

        3、在EP管中按下表步驟加樣:

        試劑名稱 (μL)

        測(cè)定管

        對(duì)照管

        標(biāo)準(zhǔn)管

        空白管

        樣本

        40

        40

        -

        -

        標(biāo)準(zhǔn)液

        -

        -

        40

        -

        蒸餾水

        -

        -

        -

        40

        試劑二工作液

        40

        -

        40

        40

        試劑三

        20

        60

        20

        20

        37℃酶促反應(yīng)1h

        試劑四

        160

        160

        160

        160

        試劑五

        10

        10

        10

        10

        試劑六

        30

        30

        30

        30

             37避光反應(yīng)1h,12000g 常溫離心5min,吸取200μL上清,于450nm處測(cè)定吸光值,分別記為A測(cè)定A對(duì)照、A標(biāo)準(zhǔn)、A空白。分別計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照,ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白(標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只需做1-2次,每個(gè)測(cè)定管需設(shè)置一個(gè)對(duì)照管)。ΔA測(cè)定的測(cè)定范圍在0.005-0.7之間。

        三、谷*酰胺含量的計(jì)算

        1)按樣本蛋白質(zhì)濃度計(jì)算(蛋白濃度需自行測(cè)定):

        谷*酰胺含量(μmol/mg prot= ΔA測(cè)定×C標(biāo)準(zhǔn)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V樣總÷Cpr×V樣總)= ΔA測(cè)定×0.4÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr

         

        2)按樣本質(zhì)量計(jì)算:

        谷*酰胺含量(μmol/g 質(zhì)量)= ΔA測(cè)定×C標(biāo)準(zhǔn)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V樣總÷W=ΔA測(cè)定×0.4÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W

        3)按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計(jì)算:

        谷*酰胺含量(μmol/104cell= ΔA測(cè)定×C標(biāo)準(zhǔn)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V樣總÷N= ΔA測(cè)定×0.4÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N

        4)按照液體樣本體積計(jì)算:

        谷*酰胺含量(μmol/mLΔA測(cè)定×C標(biāo)準(zhǔn)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)ΔA測(cè)定×0.4÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)

        C標(biāo)準(zhǔn):標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度,0.4μmol/mL;V樣總:加入提取液一之后的樣本體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,gN:細(xì)胞數(shù)量,萬(wàn)個(gè)。

        注意事項(xiàng):

        1、 如果需要測(cè)蛋白濃度,需在加提取液二之前測(cè)定蛋白濃度。

        2、 如果離心后待測(cè)的上清依然渾濁,可嘗試加大離心轉(zhuǎn)速或者延長(zhǎng)時(shí)間,例如12000g 4℃離心5min

        3、 ΔA測(cè)定的測(cè)定范圍在0.005-0.7之間。如果測(cè)定吸光值超過(guò)線性范圍吸光值,可以用蒸餾水稀釋樣本后再次測(cè)定,如果測(cè)定吸光值小于線性范圍吸光值,需要增加樣本量后再次測(cè)定,注意同步計(jì)算公式。

        實(shí)驗(yàn)實(shí)例:

        1. 0.1011g草莓,將樣本進(jìn)行前處理,用蒸餾水稀釋2倍后按照測(cè)定步驟操作,96孔板測(cè)得計(jì)算A測(cè)定 = 0.37A對(duì)照 = 0.1,?A測(cè)定= 0.27A標(biāo)準(zhǔn)=0.466,A空白=0.094,ΔA標(biāo)準(zhǔn)=0.372。按樣本質(zhì)量計(jì)算Gln含量得:

        谷*酰胺含量(μmol/g 質(zhì)量)=ΔA測(cè)定×0.4÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×2=5.7433μmol/g 質(zhì)量。

        2. 0.1081g兔肌肉,將樣本進(jìn)行前處理,用蒸餾水稀釋2倍后按照測(cè)定步驟操作,96孔板測(cè)得計(jì)算A測(cè)定 = 0.349A對(duì)照 = 0.147,?A測(cè)定= 0.202A標(biāo)準(zhǔn)=0.466,A空白=0.094ΔA標(biāo)準(zhǔn)=0.372。按樣本質(zhì)量計(jì)算Gln含量得:

        谷*酰胺含量(μmol/g 質(zhì)量)=ΔA測(cè)定×0.4÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×2=4.0186μmol/g 質(zhì)量。

        3. 0.5mL羊血清,將樣本用蒸餾水稀釋2按照測(cè)定步驟操作,96孔板測(cè)得計(jì)算A測(cè)定 = 0.155,A對(duì)照 = 0.118?A測(cè)定= 0.037,A標(biāo)準(zhǔn)=0.466A空白=0.094,ΔA標(biāo)準(zhǔn)=0.372按樣本質(zhì)量計(jì)算Gln含量得:

        谷*酰胺含量(μmol/mL=ΔA測(cè)定×0.4÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×2=0.0796μmol/mL。

        參考文獻(xiàn):

        [1] Tsao M, Otter D E. Quantification of glutamine in proteins and peptides using enzymatic hydrolysis and reverse-phase high-performance liquid chromatography[J]. Analytical Biochemistry, 1999, 269(1):143-148.

        [2] Seegmiller J E, Schwartz R, Davidson C S. The plasma ammonia and glutamine content in patients with hepatic coma[J]. Journal of Clinical Investigation, 1954, 33(7), 984.

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