植酸酶活性檢測試劑盒

微量法

貨號：BC3145

規(guī)格：100T/48S

產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前加入到緩沖液中（可吸取緩沖液到試劑一瓶中反復沖洗），充分震蕩溶解，用不完的試劑2-8℃可保存4周。

2. 試劑二：臨用前加入3.15mL蒸餾水充分溶解，再將槍頭伸入液面下緩慢加入0.85mL濃硫酸，2-8℃可保存4周。

3. 試劑三：臨用前加入20mL蒸餾水充分溶解，2-8℃可保存4周。。

4. 工作液：臨用前根據測定數量將試劑二：試劑三=1mL：5mL (約40T)的比例混勻，配制后于2-8℃可保存3天。

5. 標準品：5μmol/mL無機磷標準液。

產品說明：

植酸酶（Phytase）又叫肌醇六磷酸酶，是一種蛋白質和糖的結合酶，植酸酶可以分解植酸產生無機磷和肌醇，極大的提高生物對養(yǎng)分的利用率，天然植酸酶廣泛存在于植物、動物組織和微生物中，現多用微生物來合成植酸酶進行生產應用，植酸酶在糧食生產、畜牧養(yǎng)殖領域具有廣泛的研究價值。

在一定的環(huán)境條件下，植酸酶可以分解植酸鈉（肌醇六磷酸十二鈉）產生無機磷和肌醇衍生物，在酸性條件下，無機磷和鉬酸銨顯色劑發(fā)生反應，產生藍色的鉬藍物質，其在700nm有特征吸收峰，通過測定無機磷的含量，可計算出植酸酶的活性。 

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調式移液器、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、濃硫酸、微量玻璃比色皿/96孔板、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織：按照樣本質量（g）：提取液體積（mL）為1:5~10 的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿；4000g 4℃離心10min（若仍然渾濁，可延長離心時間），取上清置冰上待測。

2. 細菌或細胞樣本：收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清，按照細菌或細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為 500~1000:1 的比例（建議500萬細菌或細胞加入 1mL 提取液）加入提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率200W，超聲 3s，間隔 7s，總時間3min），4000g 4℃離心10min，取上清置冰上待測。

3. 培養(yǎng)液或其他液體：直接檢測。若溶液渾濁則離心后取上清進行測定。

二、測定步驟

1、可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至700nm，可見分光光度計用蒸餾水調零。

2、標準溶液的稀釋：將5μmol/mL無機磷標準液用蒸餾水稀釋至5、3、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μmol/mL備用。

3、標準溶液稀釋可參考下表：

備注：實驗中每個標準管需50µL標準溶液。

4、在EP管中按下表步驟加樣：

     常溫靜置10min，8000g，室溫離心10min，吸取200μL上清，于700nm處測定吸光值，分別記為A_測定、A_對照、A_標準、A_空白。分別計算 ΔA=A_測定-A_對照，ΔA標準=A_標準-A_空白（標準曲線和空白管只需做 1-2 次，每個測定管需設置一個對照管）。

二、植酸酶活性的計算

1. 標準曲線的繪制

根據標準管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標準（y，ΔA標準），建立標準曲線。根據標準曲線，將ΔA（y，ΔA）代入公式計算樣本濃度（x，μmol/mL）。

2. 植酸酶活性計算

（1）按樣本蛋白質濃度計算

單位定義：在37℃，pH5.5環(huán)境下，每mg組織蛋白每分鐘在反應體系釋放1μmol無機磷為1個酶活力單位。

植酸酶活性（U/mg prot）= x×V樣總÷（Cpr×V樣總）÷T= x÷Cpr÷30；

（2）按樣本質量計算

單位定義：在37℃，pH5.5環(huán)境下，每g組織每分鐘在反應體系釋放1μmol無機磷為1個酶活力單位。

植酸酶活性（U/g 質量）= x×V樣總÷W÷T=x÷W÷30；

（3）按細菌/細胞數量計算

單位定義：在37℃，pH5.5環(huán)境下，每10⁴個細胞每分鐘在反應體系釋放1μmol無機磷為1個酶活力單位。

植酸酶活性（U/10⁴cell）=  x×V樣總÷N÷T= x÷N÷30；

（4）按照液體樣本體積計算

單位定義：在37℃，pH5.5環(huán)境下，每mL樣本每分鐘在反應體系釋放1μmol無機磷為1個酶活力單位。

植酸酶活性（U/mL）= x×V樣÷V樣÷T= x÷30；

V樣：加入樣本體積，0.05mL；V樣總：提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，30min；N：細胞數量，以萬計。

注意事項：

1. 為防止沸水浴10min過程中水分散失，建議使用螺旋管或用封口膜給EP管纏口。

2. 如果測定吸光值過低或接近空白，適當延長反應時間或加大樣本量后，重新測定。如果A_測定大于1.5或者ΔA超過檢測范圍，建議將樣本用蒸餾水進行適當稀釋后進行測定。注意同步修改計算公式。

3. 結果于40min內測定完畢。

實驗實例：

取0.15g菠菜種子（已發(fā)芽），按照測定步驟操作，測得計算A_測定 = 0.692，A_對照 = 0.573，?A= 0.119，將?A代入標曲公式y = 0.2991x + 0.0121，得出x= 0.357，按樣本質量計算酶活得：

植酸酶活性（U/g 質量）= 0.0794 U/g 質量。

參考文獻：

[1] Senna R , Simonin V , Silva-Neto M A C , et al. Induction of acid phosphatase activity during germination of maize (Zea mays) seeds.[J]. Plant Physiology & Biochemistry, 2006, 44(7-9):467-473.

[2] Iqbal T H , Lewis K O , Cooper B T . Phytase activity in the human and rat small intestine[J]. Gut, 1994, 35(9):1233-1236.

[3] Azeke M A ,  Egielewa S J ,  Ihimire E . Effect of germination on the phytase activity, phytate and total phosphorus contents of rice (Oryza sativa), maize (Zea mays), millet (Panicum miliaceum), sorghum (Sorghum bicolor) and wheat (Triticum aestivum)[J]. Journal of Food Science&Technology, 2011.

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