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        • 丙酮酸含量檢測試劑盒 微量法
        產(chǎn)品名稱:

        丙酮酸含量檢測試劑盒 微量法

        產(chǎn)品品牌: SOLARBIO/索萊寶 價格:
        廠商性質(zhì): 生產(chǎn)廠家 產(chǎn)品時間: 2024-04-19
        丙酮酸含量檢測試劑盒 微量法
        儲存條件
        -20℃
        有效期
        6個月
        單位

        英文名稱
        Pyruvate (PA) Content Assay Kit(Enzymatic Method)
        檢測方法
        微量法 Spectrophotometer/Microplate Reader
        規(guī)格
        100T/48S

        產(chǎn)品概述

        品牌SOLARBIO/索萊寶CAS詳詢
        分子式詳詢純度詳詢
        分子量詳詢貨號BC5265
        規(guī)格100T/48S供貨周期現(xiàn)貨
        主要用途丙酮酸含量檢測應(yīng)用領(lǐng)域環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,綜合

        丙酮酸(PA含量檢測試劑盒(酶法)說明書

                                                       微量法

        注意:本產(chǎn)品試劑有所變動,請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

        貨號:BC5265

        規(guī)格:100T/48S

        產(chǎn)品組成:使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

        試劑名稱

        規(guī)格

        保存條件

        提取液

        液體60mL×1

        2-8℃保存

        試劑一

        液體25mL×1

        2-8℃保存

        試劑二

        粉劑×1

        -20℃保存

        試劑三

        液體13μL×1

        2-8℃保存

        試劑四

        液體4 mL×1

        2-8℃保存

        標(biāo)準(zhǔn)品

        液體1 mL×1

        2-8℃保存

        溶液的配制:

        1、 試劑二:臨用前加入1.2mL蒸餾水充分溶解,分裝保存,-20℃可以保存4,避免反復(fù)凍融;

        2、 試劑三:臨用前按試劑三:蒸餾水=1μL100μL(約6T)的比例進(jìn)行稀釋,現(xiàn)用現(xiàn)配。

        3、 標(biāo)準(zhǔn)品:20 μmol/mL丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液。

        產(chǎn)品說明:

        丙酮酸通過乙酰 CoA 連接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代謝,起著重要的樞紐作用。

        pH = 7.5 時,丙酮酸在LDH的催化作用下與NADH反應(yīng),生成NAD + 和乳酸。在1-mPMS作用下,WST-1可與NADH反應(yīng),產(chǎn)生水溶性formazan。通過檢測450nm條件下吸光值,可以計算出丙酮酸含量。


        注意:實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

        需自備的儀器和用品:

        可見分光光度計/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液槍、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

        操作步驟:

        一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn))

        1. 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(106個):提取液體積(mL)為5~101的比例(建議5百萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 200w,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

        2. 組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

        3. 血清(漿)等其他液體:直接檢測。若有沉淀請離心后取上清待測。

        二、測定步驟

        1、 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長到450nm,分光光度計蒸餾水調(diào)零。

        2、 試劑一37℃預(yù)熱20min。

        3、 標(biāo)準(zhǔn)品的制備:將20μmol/mL丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋得到10.625、0.50.3125、0.25、0.15625μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

        4、 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋表:

        序號

        稀釋前濃度(μmol/mL

        標(biāo)準(zhǔn)液體積(µL

        蒸餾水體積(µL

        稀釋后濃度μmol/mL

        1

        20

        50

        950

        1

        2

        1

        625

        375

        0.625

        3

        0.625

        800

        200

        0.5

        4

        0.5

        625

        375

        0.3125

        5

        0.3125

        800

        200

        0.25

        6

        0.25

        625

        375

        0.15625

        實驗中每個標(biāo)準(zhǔn)管需20µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

        5、 操作表:(在1.5mL EP管中依次加入下列試劑)

        試劑名稱(µL

        測定管

        對照管

        標(biāo)準(zhǔn)管

        空白管1

        空白管2

        上清液

        20

        20

        -

        -


        標(biāo)準(zhǔn)品

        -

        -

        20

        -


        蒸餾水

        -

        -

        -

        20

        40

        試劑一

        155

        180

        155

        155

        155

        試劑二

        10

        -

        10

        10

        10

        試劑三

        15

        -

        15

        15

        15

        37℃避光反應(yīng)30min

        -

        試劑四

        20

        20

        20

        20

        -

        37℃避光反應(yīng)30min。吸取200μL于微量玻璃比色皿或者96孔板中,測定450nm下的吸光度,計算
        ΔA測定=A空白1- A空白2-A測定-A對照),ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A空白1-A標(biāo)準(zhǔn)。(標(biāo)準(zhǔn)曲線、空白管1、空白管2只需測1-2次即可)

        三、丙酮酸含量計算

        1、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:

        根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度(x,μmol/mL)和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)y,ΔA標(biāo)準(zhǔn)),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,ΔA測定代入方程得到xμmol/mL。

        2、丙酮酸含量計算:

        1)按液體樣本的體積計算

        丙酮酸含量(μmol/mL=x×V÷V= x

        2)按組織質(zhì)量計算

        丙酮酸含量(μmol/g 質(zhì)量)= x×V÷(V÷V×W) = x÷W

        3)按蛋白濃度計算

        丙酮酸含量(μmol/mg prot= x×V÷Cpr×V樣)= x÷Cpr

        4)按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計算

        丙酮酸含量(μmol/106 cell= x ×V÷V÷V×N= x÷N

        V樣:加入的樣本體積,0.02mLCpr:上清液蛋白濃度,mg/mL;V提:加入提取液的體積,1mLW:樣本質(zhì)量,g;N:細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量,以百萬計。

        注意事項:

        1. 如果測定吸光值超過線性范圍吸光值,可以增加樣本量或者用蒸餾水稀釋樣本后再進(jìn)行測定。

        實驗實例:

        1、 稱取約0.1g鼠肺,加入1mL提取液,冰浴研磨,8000g,4℃離心10min,取上清待測。之后按照測定步驟操作,用96孔板測得計算ΔA測定=A空白1- A空白2-A測定-A對照=1.156-0.045-0.595-0.271=0.787,標(biāo)曲y=0.8502x+0.0217x=0.900µmol/mL, 計算丙酮酸含量得:

        丙酮酸含量(µmol/g 質(zhì)量)= x×V÷(V÷V×W) = x÷W =9.00µmol/g 質(zhì)量。

        2、 稱取約0.1g鳶尾,加入1mL提取液,冰浴研磨,8000g, 4℃離心10min,取上清待測。之后按照測定步驟操作,用96孔板測得計算ΔA測定=A空白1- A空白2-A測定-A對照=1.156-0.045-0.545-0.207=0.773,標(biāo)曲y=0.8502x+0.0217x=0.884µmol/mL, 計算丙酮酸含量得:

        丙酮酸含量(µmol/g 質(zhì)量) = x×V÷(V÷V×W) = x÷W =8.837µmol/g 質(zhì)量。

        3、 收集約500萬細(xì)胞,加入1mL提取液,超聲波破碎(功率 200w,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次),8000g,4℃離心10min,取上清待測。之后按照測定步驟操作,用96孔板測得計算ΔA測定= A空白1- A空白2-A測定-A對照=1.156-0.045-0.770-0.098=0.439,標(biāo)曲y=0.8502x+0.0217,x=0.491µmol/mL, 計算丙酮酸含量得:

        丙酮酸含量(μmol/106 cell= x ×V÷V÷V×5=0.2 x= 0.098 μmol/106 cell

        4、 吸取0.02mL的馬血清,按照測定步驟操作,用96孔板測得計算ΔA測定= A空白1- A空白2-A測定-A對照=1.156-0.045-1.139-0.113=0.085,標(biāo)曲y=0.8502x+0.0217x=0.074µmol/mL, 計算丙酮酸含量得:

        丙酮酸含量(μmol/mL=x×V÷V= x =0.074μmol/mL。

        相關(guān)系列產(chǎn)品:

        BC0380/BC0385  丙酮酸脫氫酶(PDH)活性檢測試劑盒

        BC0710/BC0715  α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)活性檢測試劑盒

        BC0950/BC0955  琥珀酸脫氫酶(SDH)活性檢測試劑盒

        丙酮酸含量檢測試劑盒 微量法 丙酮酸含量檢測試劑盒 微量法

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