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        • D-乳酸脫氫酶活性檢測(cè)試劑盒 微量法
        產(chǎn)品名稱(chēng):

        D-乳酸脫氫酶活性檢測(cè)試劑盒 微量法

        產(chǎn)品品牌: SOLARBIO/索萊寶 價(jià)格:
        廠商性質(zhì): 生產(chǎn)廠家 產(chǎn)品時(shí)間: 2024-04-19
        D-乳酸脫氫酶活性檢測(cè)試劑盒 微量法
        儲(chǔ)存條件
        -20℃
        有效期
        6個(gè)月
        單位

        英文名稱(chēng)
        D-lactate Dehydrogenase(D-LDH)Activity Assay Kit
        檢測(cè)方法
        微量法 Spectrophotometer/Microplate Reader
        規(guī)格
        100T/48S

        產(chǎn)品概述

        品牌SOLARBIO/索萊寶CAS詳詢(xún)
        分子式詳詢(xún)純度詳詢(xún)
        分子量詳詢(xún)貨號(hào)BC5285
        規(guī)格100T/48S供貨周期現(xiàn)貨
        主要用途D-乳酸脫氫酶活性檢測(cè)應(yīng)用領(lǐng)域環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,綜合

        D-乳酸脫氫酶(D-LDH)活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

        微量法

        貨號(hào):BC5285

        規(guī)格:100T/48S

        產(chǎn)品組成:使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致,有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

        試劑名稱(chēng)

        規(guī)格

        保存條件

        提取液

        液體60 mL×1

        2-8℃保存

        試劑一

        液體7 mL×1

        2-8℃保存

        試劑二

        粉劑×1

        -20℃保存

        試劑三

        液體7 mL×1

        2-8℃保存

        試劑四

        液體20 mL×1

        2-8℃保存

        標(biāo)準(zhǔn)

        液體1 mL×1

        2-8℃保存

        溶液的配制:

        1、 試劑二:臨用前加入0.8 mL蒸餾,充分溶解。用不完的試劑分裝保存,-20℃保存4,避免反復(fù)凍融

        2、 標(biāo)準(zhǔn)品:20 μmol/mL 酸鈉溶液

        產(chǎn)品說(shuō)明:

        乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是糖酵解途徑的末端酶,催化丙 酮酸與乳,苯 肼,酸之間的可逆反應(yīng),伴隨著NAD+/NADH之間互變。根據(jù)其催化底物-乳酸構(gòu)型的不同,可分為D-乳酸脫氫酶(D-LDH,EC 1.1.1.28)與L-乳酸脫氫酶(L-LDHEC 1.1.1.27)。

        D-LDH催化NAD+氧化D-乳酸生成酸,酸進(jìn)一步與2,4-二硝* 肼作用生成酸二硝基 苯腙,在堿性溶液中顯棕紅色,顏色深淺與酸濃度成正比。

        注意:實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

        自備的儀器用品:

        可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

        操作步驟:

        一、樣本處理可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn)

         

        1. 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

        2. 組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱(chēng)取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

        3. 血清(漿)等其他液體:直接檢測(cè)。若有沉淀請(qǐng)離心后取上清待測(cè)

        、測(cè)定步驟

        1、 可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至450nm,分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

        2、 標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋?zhuān)?/span>20μmol/mL酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水進(jìn)行稀釋得到21、0.5、0.25、0.1250.0625、0.031250.015625、0.0078125μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

        3、 標(biāo)準(zhǔn)液稀釋可參考下表

        序號(hào)

        稀釋前濃度(μmol/mL

        標(biāo)準(zhǔn)液體積(µL

        蒸餾水體積(µL

        稀釋后濃度(μmol/mL

        1

        20

        100

        900

        2

        2

        2

        100

        100

        1

        3

        1

        100

        100

        0.5

        4

        0.5

        100

        100

        0.25

        5

        0.25

        100

        100

        0.125

        6

        0.125

        100

        100

        0.0625

        7

        0.0625

        100

        100

        0.03125

        8

        0.03125

        100

        100

        0.015625

        9

        0.015625

        100

        100

        0.0078125

        備注:實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需10µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

        4、 1.5mLEP/96孔板按下表步驟加樣

        試劑名稱(chēng)(μL)

        測(cè)定管

        對(duì)照管

        標(biāo)準(zhǔn)管

        空白管

        待測(cè)樣本

        10

        10

        -

        -

        標(biāo)準(zhǔn)液

        -

        -

        10

        -

        試劑一

        50

        50

        50

        50

        試劑二

        10

        -

        -

        -

        蒸餾水

        -

        10

        10

        20

        充分混勻,37℃水浴15min

        試劑三

        50

        50

        50

        50

        充分混勻,37℃水浴15min

        試劑四

        150

        150

        150

        150

        充分混勻,室溫靜置3min,取200μL轉(zhuǎn)移至微量玻璃比色皿或96孔板中,450nm下測(cè)定吸光度,計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。空白管和標(biāo)準(zhǔn)曲線只需做1-2次,每個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

        三、D-LDH活性計(jì)算

        1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

         

        根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度(x,μmol/mL)和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)(yΔA標(biāo)準(zhǔn)),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,將ΔA測(cè)定(y,ΔA測(cè)定)帶入公式計(jì)算樣本濃度(x,μmol/mL。

        2. D-LDH活性計(jì)算

        (1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

        單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol酸定義為一個(gè)酶活力單位。

        D-LDH活性U/mg prot= x×V÷Cpr×V樣)÷T×103×F=66.6x÷Cpr×F

        (2) 按樣本質(zhì)量計(jì)算

        單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol酸定義為一個(gè)酶活力單位。

        D-LDH活性U/g 質(zhì)量)= x×V÷W÷V樣總×V樣)÷T×103×F=66.67×x÷W×F

        (3) 按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

        單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol酸定義為一個(gè)酶活力單位。

        (4) D-LDH活性U/104 cell= x×V÷N÷V樣總×V樣)÷T×103×F=66.67×x×F÷N

        (5) 血清(漿)等液體體積計(jì)算

        單位的定義:每mL血清(漿)等液體每分鐘催化產(chǎn)生1nmol酸定義為一個(gè)酶活力單位。

        D-LDH活性U/mL=x×V÷V÷T×103×F=66.6x×F

        V樣:反應(yīng)體系中加入的樣本體積,0.01mLV樣總:加入的提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時(shí)間,15min;Cpr蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,gN細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量,以萬(wàn)計(jì);103:?jiǎn)挝粨Q算系數(shù),1μmol/mL=103nmol/mL;F:樣本稀釋倍數(shù)。

        注意事項(xiàng)

        1. 如果測(cè)定管吸光值接近空白或ΔA測(cè)定過(guò)低,可適當(dāng)加大樣本量后重新測(cè)定;如果測(cè)定管吸光值超過(guò)1.5ΔA測(cè)定超過(guò)0.4,建議將樣本用提取液適當(dāng)稀釋后進(jìn)行測(cè)定。注意同步修改計(jì)算公式。

        實(shí)驗(yàn)實(shí)例

        1、 0.109g兔腎加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿,按照測(cè)定步驟操作,96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.425-0.298=0.127,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.5379x+0.0087,計(jì)算x=0.220,按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得:

        D-LDH活性U/g 質(zhì)量)=66.67×x÷W×F =134.520 U/g 質(zhì)量

        2、 0.1018g擬南芥加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿,按照測(cè)定步驟操作,96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.236-0.196=0.04,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.5379x+0.0087,計(jì)算x=0.058,按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得:

        D-LDH活性U/g 質(zhì)量)=66.67×x÷W×F =38.109 U/g 質(zhì)量

        3、 500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿,按照測(cè)定步驟操作,96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.225-0.174=0.051,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.5379x+0.0087,計(jì)算x=0.079,按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)目計(jì)算酶活得:

        D-LDH活性U/104 cell=0.133×x×F =0.010 U/104 cell

        4、 10μL胎牛血清,按照測(cè)定步驟操作,96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.322-0.201=0.121,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.5379x+0.0087,計(jì)算x=0.209,按液體體積計(jì)算酶活得:

        D-LDH活性U/mL=66.6x×F =13.919 U/mL

        參考文獻(xiàn):

         

        [1] Huang P H, Fu L C, Huang C S, et al. The uptake of oligogalacturonide and its effect on growth inhibition, lactate dehydrogenase activity and galactin-3 release of human cancer cells[J]. Food chemistry, 2012, 132(4): 1987-1995.

        [2] Huang Y N, Xu G T, You C P. The research progress of the lactate dehydrogenases in lactic acid bacteria[J]. Science and Technology of Food Industry, 2016, (08): 369-373.

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