β-淀*酶（β-AL）活性檢測試劑盒（碘-淀粉比色法）說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號：BC4585

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前加入15mL試劑三，置于常溫水中并加熱至煮沸，期間不斷攪拌粉劑至溶解，用不完的試劑2-8℃保存8周；

2、 標(biāo)準(zhǔn)品：10 mg淀粉標(biāo)準(zhǔn)品。臨用前加10 mL試劑三，置沸水浴中振蕩溶解，配成1 mg/mL淀粉標(biāo)準(zhǔn)液。2-8℃保存四周。

產(chǎn)品說明：

淀*酶負(fù)責(zé)水解淀粉，主要包括α-淀*酶和β-淀*酶。β-淀*酶(EC 3.2.1.2) 從淀粉的非還原端切開α-1,4糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖。

碘可以與未被淀*酶水解的淀粉結(jié)合，生成在570nm下有特征吸收峰的復(fù)合物，其深淺可計算出淀*酶的活力單位。α-AL耐熱不耐酸，β-AL耐酸不耐熱。根據(jù)上述特性，鈍化其中之一，就可測得另一種活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織：稱取約0.1g樣本，加1mL蒸餾水勻漿；勻漿后在室溫下放置提取15min，每隔5min振蕩1次，使其充分提??；6000g，常溫離心10min，吸取上清液即為淀*酶原液。

2、液體：直接檢測。（若有渾濁則離心后測定）

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至570nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零。

2、 將淀粉標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

實(shí)驗(yàn)中每個標(biāo)準(zhǔn)管需100µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3、 按操作表依次加入各試劑：

混勻后吸取200μL于微量玻璃比色皿或者96孔板中測定570nm下的吸光度，從左到右分別記為A1、A2、A3、A4、A5和A6，計算ΔAα=A5-（A1-A2），ΔA總=A5-（A3-A4），ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A6-A7?？瞻坠?、標(biāo)準(zhǔn)曲線只需做1-2次。

三、β-淀*酶活性計算

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，mg/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。將ΔAα測定帶入方程得到x₁（mg/mL），ΔA總代入方程得到x₂（mg/mL）。

2、α淀*酶活性的計算

（1）按照樣本質(zhì)量計算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1mg 淀粉定義為1個酶活力單位。

α-淀*酶活性(U/g 質(zhì)量)=x₁×V樣÷(W×V樣÷V樣總)÷T=0.2×x₁÷W

（2）按照蛋白質(zhì)濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1mg淀粉定義為1個酶活性單位。

α-淀*酶活性(U/mg prot)= x₁×V樣÷（V樣×Cpr）÷T=0.2×x₁÷Cpr

（3）按液體體積計算：

單位定義：每mL液體每分鐘消耗1mg淀粉定義為1個酶活性單位。

α-淀*酶活性(U/mL)= x₁×V樣÷V樣÷T=0.2×x₁

V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；V樣總：樣本總體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，5min。

3、總淀*酶活性的計算

（1）按照樣本質(zhì)量計算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1mg 淀粉定義為1個酶活力單位。

總淀*酶活性(U/g 質(zhì)量)=x₂×V樣÷(W×V樣÷V樣總)÷T=0.2×x₂÷W

（2）按照蛋白質(zhì)濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1mg淀粉定義為1個酶活性單位。

總淀*酶活性(U/mg prot)= x₂×V樣÷（V樣×Cpr）÷T=0.2×x₂÷Cpr

（3）按液體體積計算：

單位定義：每mL液體每分鐘消耗1mg淀粉定義為1個酶活性單位。

總淀*酶活性(U/mL)= x₂×V樣÷V樣÷T=0.2×x₂

V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；V樣總：樣本總體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，5min。

4、β-淀*酶活性的計算

（1）按照樣本質(zhì)量計算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1mg 淀粉定義為1個酶活力單位。

β-淀*酶活性(U/g 質(zhì)量)=淀*酶總活性-α-淀*酶活性=0.2×x₂÷W-0.2×x₁÷W

（2）按照蛋白質(zhì)濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1mg淀粉定義為1個酶活性單位。

β-淀*酶活性(U/mg prot)=淀*酶總活性-α-淀*酶活性= 0.2×x₂÷Cpr-0.2×x₁÷Cpr

（3）按液體體積計算：

單位定義：每mL液體每分鐘消耗1mg淀粉定義為1個酶活性單位。

β-淀*酶活性(U/mL)=淀*酶總活性-α-淀*酶活性=0.2×x₂-0.2×x₁

注意事項(xiàng)：

吸光值大于1.5或者ΔA大于0.8時，可以對樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后測定。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

取約0.1g藜葉片進(jìn)行樣本處理，取上清液后按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔAα=A5-（A1-A2）=1.065-（0.849-0.220）=0.436，ΔA總=A5-（A3-A4）=1.065-（0.677-0.197）=0.585，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=2.628x-0.0051，計算x1=0.1678，x2=0.2245，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

β-淀*酶活性(U/g 質(zhì)量)=0.2×x2÷W-0.2×x1÷W=0.2×0.2245÷0.1-0.2×0.1678÷0.1=0.1134 U/g 質(zhì)量。

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