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        • 5'-核苷酸酶活性檢測試劑盒 其他系列
        產(chǎn)品名稱:

        5'-核苷酸酶活性檢測試劑盒 其他系列

        產(chǎn)品品牌: SOLARBIO/索萊寶 價格:
        廠商性質(zhì): 生產(chǎn)廠家 產(chǎn)品時間: 2024-03-22
        儲存條件
        -20℃
        中文名稱
        5'-核苷酸酶活性檢測試劑盒 其他系列
        有效期
        6個月
        單位

        英文名稱
        5'-nucleotidase(5'-NT)Activity Assay Kit
        檢測方法
        可見分光光度法 Spectrophotometer
        規(guī)格
        50T/24S

        產(chǎn)品概述

        品牌SOLARBIO/索萊寶CAS詳詢
        分子式詳詢純度詳詢
        分子量詳詢貨號BC4590
        規(guī)格50T/24S供貨周期現(xiàn)貨
        主要用途5&apos;-核苷酸酶活性檢測應(yīng)用領(lǐng)域環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,綜合

        5'-核苷酸酶(5'-NT)活性檢測試劑盒說明

        可見分光光度法

        貨號BC4590

        規(guī)格50T/24S

        產(chǎn)品內(nèi)容:使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

        試劑名稱

        規(guī)格

        保存條件

        提取液

        液體30 mL×1

        -20℃保存

        試劑一

        粉劑×2

        -20℃保存

        試劑二

        液體12 mL×2

        2-8℃保存

        試劑三

        液體30 mL×1

        2-8℃保存

        試劑四

        液體25 mL×1

        2-8℃保存

        試劑五

        粉劑×1

        2-8℃保存

        試劑六

        粉劑×1

        2-8℃保存

        試劑七

        液體12 mL×1

        常溫保存

        標準品

        粉劑×1

        2-8℃保存

        溶液的配制: 

        1、 試劑五:臨用前加入12 mL蒸餾水,充分溶解,用不完的試劑2-8℃保存兩周。

        2、 試劑六:臨用前加入12 mL蒸餾水,充分溶解,用不完的試劑2-8℃保存兩周。

        3、 工作液配制:臨用前1試劑一中加入1試劑二充分溶解;用不完的試劑-20℃分裝保存一周,現(xiàn)用現(xiàn)配。

        4、 定磷試劑的配制:按H2O:試劑五:試劑六:試劑七=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效,若是藍色則為磷污染(請根據(jù)需要,用多少配多少)。

        5、 標準品:8 mg磷標準品。臨用前加入4.6 mL試劑四溶解配制成10 μmol/mL的標準溶液,溶解后2-8℃保存兩周。

        產(chǎn)品說明:

        5'-核苷酸酶(5'-NT)是一種對底物特異性不高的水解酶,可作用于多種核苷酸。廣泛存在于各種植物、動物組織、血清血漿中。5'-NT是一種特殊的磷酸酯水解酶,它只作用于核苷-5'-磷酸如AMP(腺苷-5'-磷酸或腺苷酸)生成無機磷酸和核苷。通過定磷顯色法測定所生成的無機磷含量,可以計算出5'-NT的活性高低。

        注意:實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

        需自備的儀器和用品:

        天平、可見分光光度計、臺式離心機、低溫離心機、恒溫水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、1 mL玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

        操作步驟:

         

        一、樣本處理(可適當調(diào)整待測樣本量,具體比例可以參考文獻)

        1. 組織:按照質(zhì)量(g)﹕提取液體積(mL)15-10 的比例(建議稱取約0.1 g,加入1 mL提取液),冰上勻漿后于4℃,15000 g離心10 min,取上清置于冰上待測。

        2. 細胞:按照細胞數(shù)量(104個)﹕蒸餾水體積(mL)為500-10001 的比例(建議500萬個細胞加入1 mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300 W,超聲3 s,間隔7 s,總時間3 min);然后4℃15000 g 離心10 min,取上清置于冰上待測。

        3. 血清:直接檢測。

        二、測定步驟

        1、 分光光度計預熱30 min以上,調(diào)節(jié)波長至660 nm,蒸餾水調(diào)零。

        2、 將標準品用試劑四稀釋至0.48、0.240.12、0.060.03、0.015 μmol/mL標準液。

        3、 標準品稀釋表

        序號

        稀釋前濃度(µmol/mL

        標準液體積(µL

        試劑四體積(µL

        稀釋后濃度(µmol/mL

        1

        10

        48

        952

        0.48

        2

        0.48

        500

        500

        0.24

        3

        0.24

        500

        500

        0.12

        4

        0.12

        500

        500

        0.06

        5

        0.06

        500

        500

        0.03

        6

        0.03

        500

        500

        0.015

        實驗中每個標準管需400µL標準溶液。

        4、 操作表(在1.5 mL EP管中操作)

        (1) 酶促反應(yīng)

        試劑名稱(μL

        測定管

        對照管

        樣本

        100

        100

        工作液

        400


        漩渦混勻,37℃(哺乳動物)或25℃(植物及其他)反應(yīng)30 min

        試劑三

        500

        500

        工作液

        -

        400

        漩渦混勻,25℃,8000 rpm離心10 min,取上清進行顯色反應(yīng)

        (2) 顯色反應(yīng)

        試劑名稱(μL

        測定管

        對照管

        標準管

        空白管

        上清液

        400

        400

        -

        -

        標準液

        -

        -

        400

        -

        試劑四

        -

        -

        -

        400

        定磷試劑

        800

        800

        800

        800

        漩渦混勻,40℃顯色10 min;取1 mL反應(yīng)液于1 mL玻璃比色皿中,在660 nm下測定吸光值A,分別記為 A測定、A對照、A標準、A空白,計算ΔA標準=A標準-A空白,ΔA測定=A測定-A對照(標準曲線和空白管只需測定1-2。

         

         

        三、5'-NT活性計算

        1、 標準曲線的繪制:

        以各個標準溶液的濃度為x軸,其對應(yīng)的ΔA標準為y軸,繪制標準曲線,得到標準方程y= kx+b,將ΔA帶入方程得到xμmol/mL。

        2、 5'-NT活性的計算

        1)按樣本蛋白濃度計算

        酶活單位定義:每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。

        5'-NT酶活(U/mg prot=x×V反總÷(V×Cpr)÷T×103=333.3×x÷Cpr

        2)按樣本質(zhì)量計算

        酶活單位定義:每克組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無機磷定義為一個酶活單位。

        5'-NT酶活(U/g 質(zhì)量)=x×V反總÷(W×V÷V樣總)÷T×103=333.3×x÷W

        3)按細胞數(shù)計算:

        酶活單位定義:每104個細胞在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。

        5'-NT酶活U/104 cell=x×V反總÷(細胞數(shù)量×V÷V樣總)÷T×103=333.3×x÷細胞數(shù)量

        4)按液體體積計算:

        酶活單位定義:每毫升液體在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。

        5'-NT酶活U/mL=x×V反總÷V÷T×103=333.3×x

        V樣:酶促反應(yīng)中加入樣本體積,0.1 mL;V反總:酶促反應(yīng)總體積,1 mL;V樣總:加入提取液的體積,1 mL;W:樣本質(zhì)量,g;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;細胞數(shù)量:以萬計;T:酶促反應(yīng)時間,30 min;103:單位換算,1 μmol=103 nmol。

        注意事項:

        1. ΔA測定大于1或者A測定管大于1時,建議將樣本用試劑四稀釋后再進行測定。

        實驗實例:

        1、0.1g小鼠肝,進行樣本處理,取上清后按照測定步驟操作,測得計算ΔA測定管=A測定-A對照=0.723-0.534=0.189帶入標準曲線y=2.3928x+0.0165,計算x=0.0721,按照樣本質(zhì)量計算酶活得:

        5'-NT酶活(U/g 質(zhì)量)=333.3×x÷W=333.3×0.0721÷0.1=240.31 U/g 質(zhì)量。

        2、0.1g稗草,進行樣本處理,取上清后按照測定步驟操作,測得計算ΔA測定管=A測定-A對照=0.367-0.281=0.086,帶入標準曲線y=2.3928x+0.0165,計算x=0.0290按照樣本質(zhì)量計算酶活得:

        5'-NT酶活(U/g 質(zhì)量)=333.3×x÷W=333.3×0.0290÷0.1=96.657 U/g 質(zhì)量。

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