抗壞血酸/總抗壞血酸（AsA/T-AsA）含量檢測試劑盒（比色法）說明書

微量法

貨號：BC4635

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制： 

1、 試劑一：臨用前加入2 mL 蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑-20℃分裝避光保存；

2、 試劑六：臨用前加入10mL 70%乙醇溶液（V/V）溶解；

3、 標準品：臨用前配制，加入 1.136 mL 提取液充分溶解；吸取0.02 mL 上述溶液，加入 0.98 mL 提取液，混勻，即 1000 nmol/mL AsA標準溶液。

產(chǎn)品說明:

抗壞血酸（AsA）是輔酶、自由基清除劑、電子共體/受體和草酸鹽與酒石酸鹽生物合成的底物等。作為植物細胞中最重要的抗氧化劑，AsA在保護葉綠體免于氧化損傷起著舉足輕重的作用，也是衡量農(nóng)作物產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標之一。脫氫抗壞血酸（DHA）是AsA的可逆的氧化型，在生物體內(nèi)，與抗壞血酸共同組成氧化還原系統(tǒng)，具有電子受體作用。

AsA具有還原性，能將Fe³⁺還原成Fe²⁺，Fe²⁺與2,2’-聯(lián)吡啶形成粉紅色絡合物，在525nm處有特征性吸收峰。DTT可還原DHA生成AsA，可用于檢測樣本總抗壞血酸（AsA+DHA）含量。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

研缽/勻漿器、冰、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液器、乙醇和蒸餾水。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）: 提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1 g組織，加入 1 mL提取液）進行冰浴勻漿。13000g，4℃離心 10 min，取上清置冰上待測。

2. 細胞或細菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為 500~1000 : 1 的比例（建議500萬細胞加入1 mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300 W，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3 min）；13000g，4℃離心10 min，取上清液置冰上混勻待測。

3. 血清等液體：取500 μL樣本，加入500 μL提取液，漩渦混勻。13000g，4℃離心10 min，取上清置冰上待測。

二、 測定步驟

1.分光光度計/酶標儀預熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 525 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. AsA含量測定

AsA含量測定操作表，按照操作表加入下列試劑：

注意：加入試劑七時將槍頭伸入液面以下加入，不可懸空滴加，否則會導致液體渾濁?？瞻坠?/span>1、空白管2及標準管只需測定1-2次。

3. T-AsA含量測定

T-AsA含量測定操作表，按照操作表加入下列試劑：

注意：加入試劑七時將槍頭伸入液面以下加入，不可懸空滴加，否則會導致液體渾濁?？瞻坠?/span>1、空白管2及標準管只需測定1-2次。

三、 AsA /T-AsA含量計算公式

a、AsA含量計算

（1）按樣本質(zhì)量計算

AsA (nmol/g 質(zhì)量) =(C標準液×ΔA₁測定管÷ΔA₁標準管×V樣)÷(W×V樣÷V樣總)

=1000×ΔA₁測定管÷ΔA₁標準管÷W

（2）按細胞數(shù)量計算

AsA (nmol/10⁴ cell) =(C標準液×ΔA₁測定管÷ΔA₁標準管×V樣)÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)

=1000×ΔA₁測定管÷ΔA₁標準管÷細胞數(shù)量

（3）按液體體積計算

AsA (nmol/mL) =C標準液×ΔA₁測定管÷ΔA₁標準管×2=2000×ΔA₁測定管÷ΔA₁標準管

C標準液：標準品的濃度，1000 nmol/mL；V樣總：提取離心后上清液體積，1.0 mL；V樣：加入反應體系中上清液體積，0.015 mL；W：樣本質(zhì)量，g；2：稀釋倍數(shù)，（500μL液體+500μL提取液）÷500μL液體=2。

b、T-AsA含量計算

（1）按樣本質(zhì)量計算

T-AsA (nmol/g 質(zhì)量) = (C標準液×ΔA₂測定管÷ΔA₂標準管×V樣)÷(W×V樣÷V樣總)

=1000×ΔA₂測定管÷ΔA₂標準管÷W

（2）按細胞數(shù)量計算

T-AsA (nmol/10⁴ cell) = (C標準液×ΔA₂測定管÷ΔA₂標準管×V樣)÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)

=1000×ΔA₂測定管÷ΔA₂標準管÷細胞數(shù)量

（3）按液體體積計算

T-AsA (nmol/mL) =C標準液×ΔA₂測定管÷ΔA₂標準管×2=2000×ΔA₂測定管÷ΔA₂標準管

C 標準液：標準品的濃度，1000 nmol/mL；V樣總：提取離心后上清液體積，1.0 mL；V樣：加入反應體系中上清液體積，0.015 mL；W：樣本質(zhì)量，g；2：稀釋倍數(shù)，（500μL液體+500μL提取液）÷500μL液體=2。

c、DHA含量計算

DHA含量=T-AsA含量-AsA含量

（1）按樣本質(zhì)量計算

DHA (nmol/g 質(zhì)量) = 1000×（ΔA₂測定管÷ΔA₂標準管-ΔA₁測定管÷ΔA₁標準管）÷W

（2）按細胞數(shù)量計算

DHA (nmol/10⁴ cell) =1000×（ΔA₂測定管÷ΔA₂標準管-ΔA₁測定管÷ΔA₁標準管）÷ 細胞數(shù)量

（3）按液體體積計算

DHA (nmol/mL) =2000×（ΔA₂測定管÷ΔA₂標準管-ΔA₁測定管÷ΔA₁標準管）

注意事項：

1. 加入試劑七時將槍頭伸入液面以下加入，不可懸空滴加，否則會導致液體渾濁。

2. 空白管1、空白管2及標準管只需測定1-2次。

3. A大于1.5時，建議將樣本用提取液稀釋后再進行測定，并在計算時乘以相應的稀釋倍數(shù)。

4. 本試劑盒可單獨用于檢測樣本中AsA或T-AsA含量，也可在同時檢測AsA與T-AsA含量后計算DHA含量。

5. 樣本提取后當天檢測。

實驗實例：

1、取0.1g山楂進行樣本處理，按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA₁測定管=（A測定管-A對照管）-(A空白管1-A空白管2）=（0.178-0.063）-（0.058-0.048）=0.105、ΔA₁標準管=A標準管-A空白管1=0.386-0.058=0.328，ΔA₂測定管=（A測定管-A對照管）-(A空白管1-A空白管2）=（0.308-0.066）-（0.057-0.047）=0.232、ΔA₂標準管=A標準管-A空白管1=0.466-0.057=0.409，按照樣本質(zhì)量分別計算AsA含量及T-AsA含量得：

AsA(nmol/g 質(zhì)量)=1000×ΔA₁測定管÷ΔA₁標準管÷W= 3201.2 nmol/g 質(zhì)量

T-AsA(nmol/g 質(zhì)量) =1000×ΔA₂測定管÷ΔA₂標準管÷W= 5672.4nmol/g 質(zhì)量。

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