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        • 異檸檬酸含量檢測試劑盒 三羧酸
        產(chǎn)品名稱:

        異檸檬酸含量檢測試劑盒 三羧酸

        產(chǎn)品品牌: SOLARBIO/索萊寶 價格:
        廠商性質(zhì): 生產(chǎn)廠家 產(chǎn)品時間: 2024-07-09
        有效期
        6個月
        儲存條件
        2-8℃
        中文名稱
        異檸檬酸含量檢測試劑盒 三羧酸
        單位

        英文名稱
        Isocitric Acid Content Assay Kit
        檢測方法
        微量法
        規(guī)格
        100T/96S

        產(chǎn)品概述

        品牌SOLARBIO/索萊寶CAS詳詢
        分子式詳詢純度詳詢
        分子量詳詢貨號BC5955
        規(guī)格100T/96S供貨周期現(xiàn)貨
        主要用途異檸檬酸含量檢測應(yīng)用領(lǐng)域環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,綜合

        異檸檬酸含量檢測試劑盒說明書

        微量法

        貨號:BC5955

        規(guī)格:100T/96S

        產(chǎn)品組成:使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

        試劑名稱

        規(guī)格

        保存條件

        提取液一

        液體110 mL×1

        2-8℃保存

        提取液二

        液體20 mL×1

        2-8℃保存

        試劑一

        液體20 mL×1

        2-8℃保存

        試劑二

        液體250 μL×1

        2-8℃保存

        試劑三

        粉劑×1

        2-8℃保存

        粉劑一

        粉劑×1

        2-8℃保存

        標(biāo)準(zhǔn)品

        粉劑×1

        2-8℃保存

        溶液的配制:

        1、 試劑二工作液:臨用前先離心,根據(jù)樣本量按試劑二:蒸餾水=10μL90μL(共100μL,約5T)的比例配制后使用,現(xiàn)配現(xiàn)用。

        2、 試劑三:臨用前加入1.3 mL蒸餾水充分溶解,未用完的試劑-20℃分裝保存4周,避免反復(fù)凍融。

        3、 標(biāo)準(zhǔn)品:臨用前加入1 mL蒸餾水充分溶解成20μmol/mL異檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品。

        4、 工作液:臨用前根據(jù)樣本量按試劑一:試劑二工作液:試劑三=150μL20μL10μL(共180μL,約1T)配成工作液后使用,現(xiàn)配現(xiàn)用。

        產(chǎn)品說明:

        異檸檬酸(Isocitric Acid)是檸檬酸的異構(gòu)體,在許多水果和蔬菜以及由這些原料制成的食品中發(fā)現(xiàn)了大量的異檸檬酸鹽。生物能夠利用的是D型異檸檬酸,是三羧酸循環(huán)中的一個成分。

        異檸檬酸在異檸檬酸脫氫酶(ICDH,EC1.1.1.41)的作用下變成a-酮戊二酸,同時NADP)還原為NADPH,據(jù)此可以計算異檸檬酸含量。

        注意:實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

        需自備的儀器和用品

        紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96UV板、天平、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

        操作步驟:

        一、 樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn)

        組織:按照質(zhì)量(g):提取液一體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL提取液一)加入提取液一,冰浴勻漿后于4℃,12000g離心10min,取0.8mL上清液,再緩慢加入0.15mL提取液二,緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生,4℃ 12000g離心10min后取上清待測。(提取液二需緩慢加入,加入后會產(chǎn)生大量氣泡,建議使用2mL EP管進(jìn)行操作。

        細(xì)菌或細(xì)胞:收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(106個):提取液體積(mL)為5~101的比例(建議5×106個細(xì)胞加入1mL提取液一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);于4℃,12000g離心10min,取0.8mL上清液,再緩慢加入0.15mL提取液二,緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生,4℃ 12000g離心10min后取上清待測。(提取液二需緩慢加入,加入后會產(chǎn)生大量氣泡,建議使用2mL EP管進(jìn)行操作。

        果汁等液體:取500μL液體樣本,加1mg粉劑一混勻后沸水浴5min(纏封口膜,防止爆蓋),靜置至室溫后于4℃ 12000g離心10min,取上清待測。

        二、測定步驟

        1、 紫外分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,分光光度計用蒸餾水調(diào)零。

        2、 工作液37℃預(yù)熱10min以上。

        3、 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋:將20μmol/mL異檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水進(jìn)行稀釋得到12、10、8、4、2、1、0.5μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品備用。

        4、 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋表:

        序號

        稀釋前濃度(μmol/mL

        標(biāo)準(zhǔn)品體積(µL

        蒸餾水體積(µL

        稀釋后濃度(μmol/mL

        1

        20

        300

        200

        12

        2

        20

        300

        300

        10

        3

        10

        400

        100

        8

        4

        8

        200

        200

        4

        5

        4

        200

        200

        2

        6

        2

        200

        200

        1

        7

        1

        200

        200

        0.5

        備注:下述實驗中每個標(biāo)準(zhǔn)管需20µL標(biāo)準(zhǔn)品(注意不要在此步驟直接檢測標(biāo)準(zhǔn)品吸光度)。

        5、 樣本測定(在微量石英比色皿/96UV板中加入下列試劑)

        試劑名稱(μL

        測定管

        標(biāo)準(zhǔn)管

        空白管

        樣本

        20

        -

        -

        標(biāo)準(zhǔn)品

        -

        20

        -

        蒸餾水

        -

        -

        20

        工作液

        180

        180

        180

        充分混勻,立即測定340nm10s時的吸光度A1,然后迅速置于37℃反應(yīng)10min(酶標(biāo)儀有控溫功能的可以將溫度調(diào)至37℃),測定10min10s時的吸光度A2,分別記為A1測定、A2測定、A1標(biāo)準(zhǔn)、A2標(biāo)準(zhǔn)、A1空白、A2空白。計算ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A2標(biāo)準(zhǔn)-A1標(biāo)準(zhǔn))-A2空白-A1空白),ΔA測定=A2測定-A1測定)-A2空白-A1空白)。每個標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只需測1-2次。

        三、異檸檬酸含量計算公式

        1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度(x,μmol/mL)和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)(y,ΔA標(biāo)準(zhǔn)),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,將ΔA測定(yΔA測定)帶入公式計算樣本濃度(x,μmol/mL)。

        2. 異檸檬酸含量計算:

        1)按樣本蛋白濃度計算:

        異檸檬酸含量(μmol/g prot=x×V樣本÷Cpr×V樣本)×F=x÷Cpr×F

        2)按樣本質(zhì)量計算:

        異檸檬酸含量(μmol/g 質(zhì)量)=x×V上清+V提取液二)÷W×V上清÷V提取液一)×F=1.1875×x÷W×F

        3)按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算:

            異檸檬酸含量(μmol/106 cell= x×V上清+V提取液二)÷N×V上清÷V提取液一)×F=1.1875×x÷N×F

        4)按液體體積計算:

        異檸檬酸含量(μmol/mL=x×F

        V樣本:加入的樣本體積,0.02mL;V上清:提取時上清液體積,0.8mL;V提取液二:加入提取液二的體積,0.15mL;V提取液一:加入的提取液一體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;N:細(xì)胞數(shù)量,以百萬計;F:稀釋倍數(shù)。

        注意事項:

        1.最好兩個人同時做此實驗,一個人比色,一個人計時,以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

        2.若樣本ΔA<0.005,可適當(dāng)增大樣本量后測定;若樣本ΔA>1.0A測定>1.5,可用蒸餾水稀釋上清液后測定,

        注意同步修改計算公式中的稀釋倍數(shù)。

        3.提取液一中含有蛋白質(zhì)沉淀劑,因此上清液不能用于蛋白濃度測定,如需測定蛋白濃度,需另取組織。

        實驗實例:

        1、 0.1139g蘋果加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿,取上清后按照測定步驟操作,用96UV板測得ΔA測定=A2測定-A1測定)-A2空白-A1空白)=0.140-0.089-0.060-0.058=0.049,帶入標(biāo)曲y=0.0658x-0.0178,R2=0.9978,計算x=1.015,按樣本質(zhì)量計算異檸檬酸含量得:

        異檸檬酸含量(μmol/g 質(zhì)量)=1.1875×x÷W×F=10.582 μmol/g 質(zhì)量。

        2、 0.1033g橙子葉加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿,取上清用蒸餾水稀釋2倍后按照測定步驟操作,用96UV板測得ΔA測定=A2測定-A1測定)-A2空白-A1空白)=1.445-1.415-0.060-0.058=0.028,帶入標(biāo)曲y=0.0658x-0.0178R2=0.9978,計算x=0.696,按樣本質(zhì)量計算異檸檬酸含量得:

        異檸檬酸含量(μmol/g 質(zhì)量)=1.1875×x÷W×F=16.002 μmol/g 質(zhì)量。

        3、 500μL橙汁飲料取上清后按照測定步驟操作,用96UV板測得ΔA測定=A2測定-A1測定)-A2空白-A1空白)=0.523-0.516-0.060-0.058=0.005,帶入標(biāo)曲y=0.0658x-0.0178R2=0.9978,計算x=0.347,按樣本質(zhì)量計算異檸檬酸含量得:

        異檸檬酸含量(μmol/mL=x×F=0.347 μmol/mL

        參考文獻(xiàn):

        [1] Kvasni Ka, Franti Ek, et al. "Determination of Isocitric Acid in Citrus Juice—A Comparison of HPLC, Enzyme Set and Capillary Isotachophoresis Methods." Journal of Food Composition & Analysis 15.6(2002):685-691.

        [2] Kong, Min Jung, et al. "Mitochondrial NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase deficiency increases cisplatin-induced oxidative damage in the kidney tubule cells." Cell Death & Disease 9.5(2018):488.

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        異檸檬酸含量檢測試劑盒 三羧酸 異檸檬酸含量檢測試劑盒 三羧酸

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