亞硝酸還原酶（NiR）活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號：BC1545

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：每瓶臨用前加入2.5mL蒸餾水充分溶解，2-8℃保存2周；

2、 試劑三：臨用前加入5mL蒸餾水，可70-80℃加熱溶解；2-8℃可以保存3個月；

3、 試劑五：若出現(xiàn)沉淀，可70-80℃加熱溶解；

4、 標(biāo)準(zhǔn)品：10µmol/mL亞硝*標(biāo)準(zhǔn)溶液；

5、 工作液：臨用前根據(jù)樣本量將試劑四和試劑五按1:1的比例混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

亞硝酸還原酶（Nitrite reductase，NiR）是亞硝態(tài)氮還原過程中的關(guān)鍵酶，在自然界氮素循環(huán)過程中發(fā)揮著重要作用，其廣泛存在于微生物及植物體內(nèi)，能夠催化亞硝酸鹽還原，減少亞硝態(tài)氮在環(huán)境中的積累，降低其對生物體生長發(fā)育的毒害作用。

亞硝酸還原酶可將NO₂^-還原為NO，使樣本中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的NO₂^-減少，即540nm處吸光值的變化可反應(yīng)樣本中亞硝酸還原酶的活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、天平、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按樣本質(zhì)量（g）: 提取液體積（mL）1 : 5~10比例（建議稱取0.1g樣本，加入1.0mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后，于4 ℃，10000g，離心10min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。

2. 細(xì)菌或細(xì)胞：按細(xì)胞數(shù)量（10⁴）：提取液體積（mL）500~1000 : 1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1.0mL提取液）加入提取液，冰浴超聲破碎細(xì)胞（功率200w，超聲3s，間隔7s，總時間3min），然后于4℃，10000g，離心10min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。

二、測定步驟

1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長至540nm，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2、 標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋：將10µmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋至0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125 µmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液待測。

3、 標(biāo)準(zhǔn)液稀釋可參考下表：

備注：下述實(shí)驗(yàn)中每個標(biāo)準(zhǔn)管需70µL標(biāo)準(zhǔn)液（注意不要在此步驟直接檢測吸光值）。

4、 樣本測定：

三、亞硝酸還原酶活性計(jì)算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為x軸（x，μmol/mL），標(biāo)準(zhǔn)溶液對應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸（y，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y=kx+b，將ΔA測定帶入方程得到x（μmol/mL）。

2. 酶活計(jì)算

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每mg組織蛋白每小時還原1μmol NO₂^ˉ的量為一個酶活力單位。

NiR（U/mg prot）=x×V1÷V2×V提÷（Cpr×V提）÷T=x×7÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每g組織每小時還原1μmol NO₂^ˉ的量為一個酶活力單位。

NiR（U/g 質(zhì)量）=x×V1÷V2×V提÷W÷T=x×7÷W

（3）按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：每10⁴個細(xì)菌/細(xì)胞每小時還原1μmol NO₂^ˉ的量為一個酶活力單位。

NiR（U/10⁴ cell）=x×V1÷V2×V提÷細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量÷T=x×7÷細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量

V1：取上清液前的反應(yīng)體系體積，0.14mL；V2：加入的樣本體積，0.02mL；V提：加入的提取液體積，1.0mL；T：反應(yīng)時間，1h；W：土樣質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量：以10⁴計(jì)。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1g楊樹葉片加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，按照測定步驟操作，用96孔板測得計(jì)算ΔA測定= A基質(zhì)管-（A測定管-A對照管）=0.863-（0.705-0.065）=0.223，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=8.4313x+0.003，R²⁼0.9999，計(jì)算x=0.0261，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

NiR（U/g 質(zhì)量）=x×7÷W=0.0261×7÷0.1=1.827 U/g 質(zhì)量。

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