苯胺-4-羥化酶（AH）活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號：BC2745

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前取一瓶加入60mL蒸餾水，充分溶解；用不完的試劑2-8℃可保存4周；

2、 試劑三：臨用前取一瓶加入6mL蒸餾水，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復(fù)凍融；

3、 試劑四：臨用前加入3mL蒸餾水，充分溶解；用不完的試劑2-8℃可保存4周；

4、 試劑六：臨用前取一瓶加入6mL蒸餾水，充分溶解；用不完的試劑2-8℃密封可保存4周。

5、 標(biāo)準(zhǔn)品：10nmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液

產(chǎn)品說明：

細(xì)胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。AH在P450酶系中相當(dāng)于CYP2E1亞型，CYP2E1不僅參與了藥物的代謝，而且還能催化多種前致癌物和前毒物的活化過程。

AH催化苯胺羥化后產(chǎn)生的4-氨基酚，進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)榉?/span>-吲哚復(fù)合物，在630nm處有特征吸收峰；通過測定630nm吸光度增加速率，來計(jì)算AH活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、超速離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、研缽/勻漿器、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、 粗酶液提取（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、除去細(xì)胞核和線粒體等：稱約0.5g組織，加入4℃預(yù)冷的1mL試劑一，冰上充分研磨，10 000g，4℃離心30min，取上清液，轉(zhuǎn)移到超速離心管中。

2、粗制微粒體：4℃，100 000g，離心60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。

4、最終微粒體：向步驟3的沉淀中加0.5mL試劑二，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液，置于冰上待測。

二、測定步驟

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至630nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 試劑五置于冰浴冷卻30min。

3、 在EP管加入下列試劑：

三、AH活性計(jì)算

（1）按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃條件下，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 4-氨基酚為1個(gè)酶活單位。

AH活性(U/mg prot) = C標(biāo)× V上總×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷（Cpr×V樣）÷T

= 2×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃條件下，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 4-氨基酚為1個(gè)酶活單位。

AH活性(U /g 質(zhì)量) = C標(biāo)×V上總×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷(V樣×W÷V試劑二)÷T

=（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷W

C標(biāo)：10nmol/mL；V上總：反應(yīng)體系中上清總體積，0.3mL；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定；V樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.05mL；W：樣本質(zhì)量，g；V試劑二：提取中加入的試劑二體積，0.5mL；T：催化反應(yīng)時(shí)間，30min。

注意事項(xiàng)：

1、如果測定吸光值A＞1.5或ΔA＞1，建議稀釋樣本后再測定，計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

2、如果測定吸光值較低或接近空白OD值，建議增加樣本量后再進(jìn)行測定，注意同步修改計(jì)算公式。

3、粗酶液提取后需在當(dāng)日完成測定。

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