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        • 輔酶Ⅰ NAD(H)含量檢測試劑盒
        產(chǎn)品名稱:

        輔酶Ⅰ NAD(H)含量檢測試劑盒

        產(chǎn)品品牌: SOLARBIO/索萊寶 價格:
        廠商性質(zhì): 生產(chǎn)廠家 產(chǎn)品時間: 2024-07-09
        輔酶Ⅰ NAD(H)含量檢測試劑盒
        儲存條件
        -20℃
        有效期
        6個月
        單位

        英文名稱
        CoenzymeⅠNAD(H) Content Assay Kit (WST colorimetry)
        檢測方法
        可見分光光度法 Spectrophotometer
        規(guī)格
        50T/24S

        產(chǎn)品概述

        品牌SOLARBIO/索萊寶CAS詳詢
        分子式詳詢純度詳詢
        分子量詳詢貨號BC5190
        規(guī)格50T/24S供貨周期現(xiàn)貨
        主要用途輔酶Ⅰ NAD(H)含量檢測應(yīng)用領(lǐng)域環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,綜合

        輔酶 I NAD (H)含量檢測試劑盒WST顯色法)說明書

        可見分光光度法

        貨號BC5190

        規(guī)格50T/24S

        產(chǎn)品內(nèi)容:使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

        試劑名稱

        規(guī)格

        保存條件

        酸性提取液

        液體15 mL×1

        2-8℃保存

        堿性提取液

        液體15 mL×1

        2-8℃保存

        試劑一

        液體20 mL×1

        2-8℃保存

        試劑二

        液體6 mL×1

        2-8℃保存

        試劑三

        液體12mL×1

        2-8℃保存

        試劑四

        液體3mL×1

        -20℃保存

        試劑五

        液體40 mL×1

        2-8℃保存

        NAD標(biāo)準(zhǔn)品

        粉劑×1

        -20℃保存

        NADH標(biāo)準(zhǔn)品

        粉劑×1

        -20℃保存

        溶液的配制:

        1、 NAD標(biāo)準(zhǔn)品:臨用前加入 1.5 mL 蒸餾水,即 2 µmol/mL-20℃可以保存2周。

        2、 NADH標(biāo)準(zhǔn)品:臨用前加入 1.4 mL 蒸餾水,即 2 µmol/mL。-20℃可以保存2周。

        產(chǎn)品說明:

        輔酶I包括還原型和氧化型兩種形式,在生物氧化中起傳遞氫的作用。氧化型輔酶I又稱煙*胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)是脫氫酶的輔酶,它在糖酵解、糖異生、三羧酸循環(huán)和呼吸鏈中發(fā)揮著不可替代的作用。中間產(chǎn)物會將脫下的氫遞給NAD,使之成為NADH(還原型輔酶I)。而NADH則會作為氫的載體,在呼吸鏈中通過化學(xué)滲透偶聯(lián)的方式,合成 ATP。NAD(H)在機(jī)體內(nèi)有重要的生理意義,與物質(zhì)代謝、能量代謝、抗細(xì)胞衰老、抗氧化以及一些疾病的發(fā)生密切相關(guān)。體內(nèi)輔酶I含量降低會導(dǎo)致細(xì)胞損傷或衰亡。

        分別用酸性和堿性提取液提取樣本中NAD+NADH,在1-mPMS作用下,WST-1可與NADH 反應(yīng),產(chǎn)生水溶性formazan,在450nm下有特征吸收峰,而NAD+可被乙醇脫氫酶還原為NADH,進(jìn)一步采用WST-1檢測。

        注意:實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

        需自備的儀器和用品:

        可見分光光度計、低溫離心機(jī)、水浴鍋,研缽/勻漿器、超聲破碎儀、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、冰和蒸餾水。

        操作步驟:

         

        一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn))

        1、血清(漿)中NAD+NADH的提?。?/span>

        NAD+的提取:建議取0.1mL血清(血漿),加入0.5mL酸性提取液,煮沸5min蓋緊,以防止水分散失;冰浴冷卻后,10000g, 4℃離心10min;取200μL上清液,加入200μL堿性提取液使之中和;混勻,10000g 4℃離心 10min,取上清,冰上待測。

        NADH的提?。?/span>建議取0.1mL血清(血漿),加入0.5 mL堿性提取液,煮沸5min蓋緊,以防止水分散失;冰浴冷卻后,10000g, 4℃離心10min;取200μL上清液,加入200μL酸性提取液使之中和;混勻,10000g 4℃離心 10min,取上清,冰上待測。

        2、組織中NAD+NADH的提取:

        NAD+的提?。?/span>建議取0.1g組織質(zhì)量,加入0.5mL酸性提取液,冰浴研磨,煮沸5min蓋緊,以防止水分散失;冰浴冷卻后,10000g, 4℃離心10min;取200μL上清液,加入200μL堿性提取液使之中和;混勻,10000g 4℃離心 10min,取上清,冰上待測。

        NADH的提?。?/span>建議取0.1 g組織質(zhì)量,加入0.5 mL堿性提取液,冰浴研磨,煮沸5min蓋緊,以防止水分散失;冰浴冷卻后,10000g, 4℃離心10min;取200μL上清液,加入200μL酸性提取液使之中和;混勻,10000g 4℃離心 10min,取上清冰上待測。

        3、細(xì)胞或細(xì)菌中 NAD+  NADH 的提?。?/span>

        NAD+的提取先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),離心棄上清,建議500萬細(xì)胞或者細(xì)菌加入0.5mL酸性提取液,超聲波破碎(冰浴,功率200W,超聲3s,停10s,重復(fù)30次),煮沸5min蓋緊,以防止水分散失;冰浴冷卻后,10000g, 4℃離心10min;取200μL上清液,加入200μL堿性提取液使之中和;混勻,10000g 4℃離心 10min,取上清,冰上待測。

        NADH的提取建議500萬細(xì)胞或者細(xì)菌加入0.5mL堿性提取液,超聲波破碎(冰浴,功率200W,超聲3s,停10s,重復(fù)30次),煮沸 5min蓋緊,以防止水分散失;冰浴冷卻后,10000g4℃離心10min;取200μL上清液,加入200μL酸性提取液使之中和;混勻,10000g 4℃離心 10min,取上清,冰上待測。

        二、測定步驟

        1、 分光光度計預(yù)熱30 min以上,調(diào)節(jié)波長至450 nm,蒸餾水調(diào)零。

        2、 NAD標(biāo)準(zhǔn)品:用蒸餾水稀釋為0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.019、0nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。0nmol/mL即為空白管(A)。

        3、 NADH標(biāo)準(zhǔn)品:用蒸餾水稀釋為0.625、0.3125、0.156250.078、0.0390.019、0nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。0nmol/mL即為空白管(A)。

        4、 稀釋表

        序號

        稀釋前濃度(nmol/mL

        標(biāo)準(zhǔn)液體積(µL

        蒸餾水體積(µL

        稀釋后濃度(nmol/mL

        1

        2000

        10

        990

        20


        20

        30

        930

        0.625

        2

        0.625

        400

        400

        0.3125

        3

        0.3125

        400

        400

        0.15625

        4

        0.15625

        400

        400

        0.078

        5

        0.078

        400

        400

        0.039

        6

        0.039

        400

        400

        0.019

        7

        0

        0

        400

        0

         

         

        5、 EP管中按順序加入下列試劑:

        試劑名稱(µL

        對照管(A1、A1

        測定管(A2、A2

        標(biāo)準(zhǔn)管(A標(biāo)

        上清液

        50

        50


        標(biāo)準(zhǔn)品

        -

        -

        50

        試劑五

        500

        -

        -

        試劑一

        250

        250

        250

        試劑二

        75

        75

        75

        試劑三

        150

        150

        150

        試劑四

        35

        35

        35

        充分混勻,室溫避光反應(yīng)1h

        試劑五

        -

        500

        500

        混勻, 450nm下比色,讀取吸光值,NAD+的記為:ΔANAD= A2- A1NADH的記為ΔANADH= A2- A1,NAD標(biāo)準(zhǔn)管的記為ΔA NAD標(biāo)= A標(biāo)-A空白管。NADH標(biāo)準(zhǔn)管的記為ΔA NADH標(biāo)= A標(biāo)-A空白管。(標(biāo)準(zhǔn)曲線只需做1-2次,每個測定管需設(shè)一個對照管)

        三、NAD+NADH含量計算

        1、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:

        1NAD+標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:

        根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度(x1nmol/mL)和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)(y1,ΔA標(biāo)準(zhǔn)),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,ΔA測定代入方程得到x1nmol/mL)。

        2NADH標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度(x2nmol/mL)和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)(y2,ΔA標(biāo)準(zhǔn)),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,ΔA′代入方程得到x2nmol/mL)。

        2NAD+NADH含量計算

        (一)NAD+含量計算

        (1) 按液體體積計算:NAD+含量(nmol/mL= x1×V提取+V血清)÷V血清=11×x1

        (2) 按樣本蛋白濃度計算 NAD+ (nmol/mg prot= x1×V提取÷(V提取×Cpr)= x1 ÷ Cpr

        (3) 按樣本鮮重計算NAD+含量(nmol/g 質(zhì)量)= x1×V提取÷W= x1÷W 

        (4) 按細(xì)胞數(shù)量計算:NAD+含量(nmol/104 cell= x1×V提取÷500=0.002×x1

        (二)NADH含量計算

        (1) 按液體體積計算:NADH含量(nmol/mL= x2×V提取+V血清)÷V血清=11×x2

        (2) 按樣本蛋白濃度計算 NADH (nmol/mg prot= x2×V提取÷(V提取×Cpr)= x2 ÷ Cpr

        (3) 按樣本鮮重計算NADH含量(nmol/g 質(zhì)量)= x2×V提取÷W= x2÷W 

        (4) 按細(xì)胞數(shù)量計算:NADH含量(nmol/104 cell= x2×V提取÷500=0.002×x2

        V提?。杭尤胩崛∫后w積,1mL;V血清:血清(漿)體積,0.1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣

        本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。

         

         

        注意事項:

        1、反應(yīng)過程中注意避光。

        2、如果測定吸光值超過線性范圍吸光值,可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進(jìn)行測定。同步修改計算公式。

        實驗實例:

        1. NAD+的測定:稱取 0.1g 冬青葉片,按提取步驟提取后按照測定步驟操作,玻璃比色皿測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.113-0.089=0.024,標(biāo)準(zhǔn)曲線y1=0.5982x+0.0038,根據(jù)標(biāo)曲得出x1=0.034,NAD+含量得:

        NAD+ (nmol/g 質(zhì)量)= x1÷W=0.34 nmol/g 質(zhì)量。

        NADH的測定:稱取 0.1g 冬青葉片,按提取步驟提取后按照測定步驟操作,玻璃比色皿測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.250-0.168=0.082,標(biāo)準(zhǔn)曲線y2=0.4452x-0.0008,根據(jù)標(biāo)曲得出x2=0.186,NADH含量得:

        NADH (nmol/g 質(zhì)量)= x2÷W=1.86 nmol/g 質(zhì)量。

        2. NAD+的測定:稱取 0.1g 小鼠肝臟,按提取步驟提取后按照測定步驟操作,玻璃比色皿測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.068-0.045=0.019,標(biāo)準(zhǔn)曲線y1=0.5982x+0.0038,根據(jù)標(biāo)曲得出x1=0.025,NAD+含量得:

        NAD+ (nmol/g 質(zhì)量)= x1÷W=0.25nmol/g 質(zhì)量。

        NADH的測定:稱取 0.1g 小鼠肝臟,按提取步驟提取后按照測定步驟操作,玻璃比色皿測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.217-0.118=0.099,標(biāo)準(zhǔn)曲線y2=0.4452x-0.0008,根據(jù)標(biāo)曲得出x2=0.224,NADH含量得:

        NADH (nmol/g 質(zhì)量)= x2÷W=2.24 nmol/g 質(zhì)量。

        3. NAD+的測定:取0.1mL馬血清,按提取步驟提取后按照測定步驟操作,玻璃比色皿測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.113-0.074=0.039,標(biāo)準(zhǔn)曲線y1=0.5982x+0.0038,根據(jù)標(biāo)曲得出x1=0.059,NAD+含量得:

        NAD+ (nmol/g 質(zhì)量)= x1÷W=0.59 nmol/g 質(zhì)量。

        NADH的測定:0.1mL馬血清,按提取步驟提取后按照測定步驟操作,玻璃比色皿測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.120-0.097=0.023,標(biāo)準(zhǔn)曲線y2=0.4452x-0.0008,根據(jù)標(biāo)曲得出x2=0.053,NADH含量得:

        NADH (nmol/g 質(zhì)量)= x2÷W=0.53 nmol/g 質(zhì)量。

        相關(guān)系列產(chǎn)品:

        BC1100/BC1105  輔酶II NADPH)含量檢測試劑盒(MTT顯色法)

        BC0630/BC0635  NADH氧化酶(NOX)活性檢測試劑盒

        BC1030/BC1035  NAD激酶(NADK)活性檢測試劑盒

        BC0310/BC0315  輔酶I NADH)含量檢測試劑盒(WST顯色法)

        BC5200/BC5205  輔酶II NADPH)含量檢測試劑盒(WST顯色法)

         

        輔酶Ⅰ NAD(H)含量檢測試劑盒 輔酶Ⅰ NAD(H)含量檢測試劑盒

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