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        • 輔酶Ⅰ NAD(H)含量檢測(cè)試劑盒 微量法
        產(chǎn)品名稱:

        輔酶Ⅰ NAD(H)含量檢測(cè)試劑盒 微量法

        產(chǎn)品品牌: SOLARBIO/索萊寶 價(jià)格:
        廠商性質(zhì): 生產(chǎn)廠家 產(chǎn)品時(shí)間: 2024-07-09
        輔酶Ⅰ NAD(H)含量檢測(cè)試劑盒 微量法
        儲(chǔ)存條件
        -20℃
        有效期
        6個(gè)月
        單位

        英文名稱
        CoenzymeⅠNAD(H) Content Assay Kit (WST colorimetry)
        檢測(cè)方法
        微量法 Spectrophotometer/Microplate Reader
        規(guī)格
        100T/48S

        產(chǎn)品概述

        品牌SOLARBIO/索萊寶CAS詳詢
        分子式詳詢純度詳詢
        分子量詳詢貨號(hào)BC5195
        規(guī)格100T/48S供貨周期現(xiàn)貨
        主要用途輔酶Ⅰ NAD(H)含量檢測(cè)應(yīng)用領(lǐng)域環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,綜合

        輔酶 I NAD (H)含量檢測(cè)試劑盒(WST顯色法)說(shuō)明書(shū) 

        微量法

        貨號(hào)BC5195

        規(guī)格100T/48S

        產(chǎn)品內(nèi)容:使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致,有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

        試劑名稱

        規(guī)格

        保存條件

        酸性提取液

        液體25 mL×1

        2-8℃保存

        堿性提取液

        液體25 mL×1

        2-8℃保存

        試劑一

        液體6 mL×1

        2-8℃保存

        試劑二

        液體2 mL×1

        2-8℃保存

        試劑三

        液體4mL×1

        2-8℃保存

        試劑四

        液體0.9mL×1

        -20℃保存

        試劑五

        液體15 mL×1

        2-8℃保存

        NAD標(biāo)準(zhǔn)品

        粉劑×1

        -20℃保存

        NADH標(biāo)準(zhǔn)品

        粉劑×1

        -20℃保存

        溶液的配制:

        1、 NAD標(biāo)準(zhǔn)品:臨用前加入 1.5 mL 蒸餾水,即 2 µmol/mL。-20℃可以保存2周。

        2、 NADH標(biāo)準(zhǔn)品:臨用前加入 1.4 mL 蒸餾水,即 2 µmol/mL。-20℃可以保存2周。

        產(chǎn)品說(shuō)明:

        輔酶I包括還原型和氧化型兩種形式,在生物氧化中起傳遞氫的作用。氧化型輔酶I又稱煙*胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)是脫氫酶的輔酶,它在糖酵解、糖異生、三羧酸循環(huán)和呼吸鏈中發(fā)揮著不可替代的作用。中間產(chǎn)物會(huì)將脫下的氫遞給NAD,使之成為NADH(還原型輔酶I)。而NADH則會(huì)作為氫的載體,在呼吸鏈中通過(guò)化學(xué)滲透偶聯(lián)的方式,合成 ATPNAD(H)在機(jī)體內(nèi)有重要的生理意義,與物質(zhì)代謝、能量代謝、抗細(xì)胞衰老、抗氧化以及一些疾病的發(fā)生密切相關(guān)。體內(nèi)輔酶I含量降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷或衰亡。

        分別用酸性和堿性提取液提取樣本中NAD+NADH,在1-mPMS作用下,WST-1可與NADH 反應(yīng),產(chǎn)生水溶性formazan,在450nm下有特征吸收峰,而NAD+可被乙醇脫氫酶還原為NADH,進(jìn)一步采用WST-1檢測(cè)。

        注意:實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

        需自備的儀器和用品:

        可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋,研缽/勻漿器、超聲破碎儀、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、冰和蒸餾水。

        操作步驟:

        一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn))

        1、血清(漿)中NAD+NADH的提?。?/span>

        NAD+的提取:建議取0.1mL血清(血漿),加入0.5mL酸性提取液,煮沸5min蓋緊,以防止水分散失;冰浴冷卻后,10000g, 4℃離心10min;取200μL上清液,加入200μL堿性提取液使之中和;混勻,10000g 4℃離心 10min,取上清,冰上待測(cè)。

        NADH的提取:建議取0.1mL血清(血漿),加入0.5 mL堿性提取液,煮沸5min蓋緊,以防止水分散失;冰浴冷卻后,10000g, 4℃離心10min;取200μL上清液,加入200μL酸性提取液使之中和;混勻,10000g 4℃離心 10min,取上清,冰上待測(cè)。

        2、組織中NAD+NADH的提?。?/span>

        NAD+的提?。?/span>建議取0.1g組織質(zhì)量,加入0.5mL酸性提取液,冰浴研磨,煮沸5min蓋緊,以防止水分散失;冰浴冷卻后,10000g, 4℃離心10min;取200μL上清液,加入200μL堿性提取液使之中和;混勻,10000g 4℃離心 10min,取上清,冰上待測(cè)。

        NADH的提取:建議取0.1 g組織質(zhì)量,加入0.5 mL堿性提取液,冰浴研磨,煮沸5min蓋緊,以防止水分散失;冰浴冷卻后,10000g4℃離心10min;取200μL上清液,加入200μL酸性提取液使之中和;混勻,10000g 4℃離心 10min,取上清,冰上待測(cè)。

        3、細(xì)胞或細(xì)菌中 NAD NADH 的提?。?/span>

        NAD+的提取先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),離心棄上清,建議500萬(wàn)細(xì)胞或者細(xì)菌加入0.5mL酸性提取液,超聲波破碎(冰浴,功率200W,超聲3s,停10s,重復(fù)30次),煮沸5min蓋緊,以防止水分散失;冰浴冷卻后,10000g, 4℃離心10min;取200μL上清液,加入200μL堿性提取液使之中和;混勻,10000g 4℃離心 10min,取上清,冰上待測(cè)。

        NADH的提取建議500萬(wàn)細(xì)胞或者細(xì)菌加入0.5mL堿性提取液,超聲波破碎(冰浴,功率200W,超聲3s,停10s,重復(fù)30次),煮沸 5min蓋緊,以防止水分散失;冰浴冷卻后,10000g4℃離心10min;取200μL上清液,加入200μL酸性提取液使之中和;混勻,10000g 4℃離心 10min,取上清,冰上待測(cè)。

        二、測(cè)定步驟

        1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至450 nm,分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

        2、 NAD+標(biāo)準(zhǔn)品:用蒸餾水稀釋為1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.0390.0195、0nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,0nmol/mL即空白管。

        3、 NADH標(biāo)準(zhǔn)品:用蒸餾水稀釋為10、52.5、1.250.625、0.3125、0.15625、0.078、0nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,0nmol/mL即空白管

        4、 稀釋表(附于說(shuō)明書(shū)最后)

         

        5、 EP管中按順序加入下列試劑:

        試劑名稱(µL

        對(duì)照管(A1A1

        測(cè)定管(A2、A2

        標(biāo)準(zhǔn)管(A標(biāo)

        上清液

        10

        10


        標(biāo)準(zhǔn)品

        -

        -

        10

        試劑五

        100

        -

        -

        試劑一

        50

        50

        50

        試劑二

        15

        15

        15

        試劑三

        30

        30

        30

        試劑四

        7

        7

        7

         

        充分混勻,室溫避光反應(yīng)1h

        試劑五

        -

        100

        100

         混勻, 450nm下比色,讀取吸光值,NAD+的記為:ΔANAD= A2- A1NADH的記為ΔANADH= A2- A1,NAD標(biāo)準(zhǔn)管的記為ΔA NAD標(biāo)= A標(biāo)-A空白管。NADH標(biāo)準(zhǔn)管的記為ΔA NADH標(biāo)= A標(biāo)-A空白管。(標(biāo)準(zhǔn)曲線只需做1-2次,每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管)

        三、NAD+NADH含量計(jì)算

        1、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:

        1NAD+標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:

        根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度(x1,nmol/mL)和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)(y1ΔA標(biāo)準(zhǔn)),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,ΔA測(cè)定代入方程得到x1nmol/mL)。

        2NADH標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度(x2,nmol/mL)和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)(y2,ΔA標(biāo)準(zhǔn)),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,ΔA′代入方程得到x2nmol/mL)。

        2、NAD+NADH含量計(jì)算

        (一)NAD+含量計(jì)算

        (1) 按液體體積計(jì)算:NAD+含量(nmol/mL= x1×V提取+V血清)÷V血清=11×x1

        (2) 按樣本蛋白濃度計(jì)算 NAD+ (nmol/mg prot= x1×V提取÷(V提取×Cpr)= x1 ÷ Cpr

        (3) 按樣本鮮重計(jì)算NAD+含量(nmol/g 質(zhì)量)= x1×V提取÷W= x1÷W 

        (4) 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算:NAD+含量(nmol/104 cell= x1×V提取÷500=0.002×x1

        (二)NADH含量計(jì)算

        (1) 按液體體積計(jì)算:NADH含量(nmol/mL= x2×V提取+V血清)÷V血清=11×x2

        (2) 按樣本蛋白濃度計(jì)算 NADH (nmol/mg prot= x2×V提取÷(V提取×Cpr)= x2 ÷ Cpr

        (3) 按樣本鮮重計(jì)算NADH含量(nmol/g 質(zhì)量)= x2×V提取÷W= x2÷W 

        (4) 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算:NADH含量(nmol/104 cell= x2×V提取÷500=0.002×x2

        V提取:加入提取液體積,1mLV血清:血清(漿)體積,0.1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬(wàn)。

        注意事項(xiàng):

        1、反應(yīng)過(guò)程中注意避光。

        2、如果測(cè)定吸光值超過(guò)線性范圍吸光值,可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進(jìn)行測(cè)定。同步修改計(jì)算公式。

        實(shí)驗(yàn)實(shí)例:

        1. NAD+的測(cè)定:稱取約 0.1g 冬青葉片,按提取步驟提取后按照測(cè)定步驟操作,玻璃比色皿測(cè)得吸光值后計(jì)算 ΔA 測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.119-0.106=0.013,標(biāo)準(zhǔn)曲線y1=0.373x+0.0012,根據(jù)標(biāo)曲得出x1=0.032,NAD+含量得:NAD+ (nmol/g 質(zhì)量)= x1÷W=0.32 nmol/g 質(zhì)量。

        NADH的測(cè)定:稱取約 0.1g 冬青葉片,按提取步驟提取后按照測(cè)定步驟操作,玻璃比色皿測(cè)得吸光值后計(jì)算 ΔA 測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.172-0.128=0.044,標(biāo)準(zhǔn)曲線y2=0.1479x,根據(jù)標(biāo)曲得出x2=0.297NADH含量得:NADH (nmol/g 質(zhì)量)= x2÷W=2.97 nmol/g 質(zhì)量。

        2. NAD+的測(cè)定:稱取約 0.1g 小鼠肝臟,按提取步驟提取后按照測(cè)定步驟操作,玻璃比色皿測(cè)得吸光值后計(jì)算 ΔA 測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.119-0.105=0.014,標(biāo)準(zhǔn)曲線y1=0.373x+0.0012,根據(jù)標(biāo)曲得出x1=0.034NAD+含量得:NAD+ (nmol/g 質(zhì)量)= x1÷W=3.4nmol/g 質(zhì)量。

        NADH的測(cè)定:稱取約 0.1g 小鼠肝臟,按提取步驟提取后按照測(cè)定步驟操作,玻璃比色皿測(cè)得吸光值后計(jì)算 ΔA 測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.145-0.112=0.033,標(biāo)準(zhǔn)曲線y2=0.1479x,根據(jù)標(biāo)曲得出x2=0.223,NADH含量得:NADH (nmol/g 質(zhì)量)= x2÷W=2.23 nmol/g 質(zhì)量。

        3. NAD+的測(cè)定:取0.1mL馬血清,按提取步驟提取后按照測(cè)定步驟操作,玻璃比色皿測(cè)得吸光值后計(jì)算 ΔA 測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.114-0.097=0.017,標(biāo)準(zhǔn)曲線y1=0.373x+0.0012,根據(jù)標(biāo)曲得出x1=0.042,NAD+含量得:NAD+ (nmol/g 質(zhì)量)= x1÷W=0.42 nmol/g 質(zhì)量。

        NADH的測(cè)定:0.1mL馬血清,按提取步驟提取后按照測(cè)定步驟操作,玻璃比色皿測(cè)得吸光值后計(jì)算 ΔA 測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.142-0.135=0.007,標(biāo)準(zhǔn)曲線y2=0.1479x,根據(jù)標(biāo)曲得出x2=0.047,NADH含量得:NADH (nmol/g 質(zhì)量)= x2÷W=0.47 nmol/g 質(zhì)量。

        相關(guān)系列產(chǎn)品:

        BC1100/BC1105  輔酶II NADPH)含量檢測(cè)試劑盒(MTT顯色法)

        BC0630/BC0635  NADH氧化酶(NOX)活性檢測(cè)試劑盒

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