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        • 輔酶Ⅱ NADP(H)含量檢測試劑盒 微量法
        產(chǎn)品名稱:

        輔酶Ⅱ NADP(H)含量檢測試劑盒 微量法

        產(chǎn)品品牌: SOLARBIO/索萊寶 價格:
        廠商性質(zhì): 生產(chǎn)廠家 產(chǎn)品時間: 2024-07-09
        輔酶Ⅱ NADP(H)含量檢測試劑盒 微量法
        有效期
        6個月
        儲存條件
        -20℃
        單位

        英文名稱
        CoenzymeⅡ NADP(H) Content Assay Kit (WST colorimetry)
        檢測方法
        微量法 Spectrophotometer/Microplate Reader
        規(guī)格
        100T/48S

        產(chǎn)品概述

        品牌SOLARBIO/索萊寶CAS詳詢
        分子式詳詢純度詳詢
        分子量詳詢貨號BC5205
        規(guī)格100T/48S供貨周期現(xiàn)貨
        主要用途輔酶Ⅱ NADP(H)含量檢測應(yīng)用領(lǐng)域環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,綜合

        輔酶 II NADP(H)含量檢測試劑盒說明書WST顯色法)

        微量法

        貨號BC5205

        規(guī)格100T/48S

        產(chǎn)品內(nèi)容:使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

        試劑名稱

        規(guī)格

        保存條件

        酸性提取液

        液體25 mL×1

        2-8℃保存

        堿性提取液

        液體25 mL×1

        2-8℃保存

        試劑一

        液體10 mL×1

        2-8℃保存

        試劑二

        粉劑×1

        -20℃保存

        試劑三

        液體4mL×1

        2-8℃保存

        試劑四A

        粉劑×1

        -20℃保存

        試劑四B

        液體10mL×1

        2-8℃保存

        試劑五

        液體25 mL×1

        2-8℃保存

        NADP標(biāo)準(zhǔn)品

        粉劑×1

        -20℃保存

        NADPH標(biāo)準(zhǔn)品

        粉劑×1

        -20℃保存

        溶液的配制:

        1、 試劑二:臨用前加入4mL蒸餾水充分混勻,溶解后2-8℃保存4周。

        2、 試劑四:臨用前將試劑四A溶解到試劑四B中,分裝保存,避免反復(fù)凍融,-20℃保存4周。

        3、 NADP標(biāo)準(zhǔn)品:臨用前加入 1.27 mL 蒸餾水,即 5 µmol/mL,-20℃可以保存2周。

        4、 NADPH標(biāo)準(zhǔn)品:臨用前加入 1.2 mL 蒸餾水,即 5 µmol/mL-20℃可以保存2周。

        產(chǎn)品說明:

        輔酶Ⅱ NADP(H)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,NADP+ NADPH 含量測定可以計算 NADPNADPH + NADP+)含量和 NADPH/NADP+比值,其變化與磷酸戊糖途徑和生物合成以及抗氧化反應(yīng)密切相關(guān)。NADPH/NADP+比值不僅是細(xì)胞氧化還原態(tài)的主要標(biāo)志之一,而且在 PPP 途徑、生物合成和抗氧化代謝中具有重要調(diào)控作用。

        分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NADP+NADPH。1-mPMS作用下,WST-1可與NADPH 反應(yīng),產(chǎn)生水溶性formazan,在450nm下有特征吸收峰,而NADP+可被6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原為NADPH,進(jìn)一步采用WST-1檢測。

         

        注意:實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

        需自備的儀器和用品:

        可見分光光度計/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋、研缽/勻漿器、超聲破碎儀,可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、冰和蒸餾水。

        操作步驟:

         

        一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn))

        1、血清(漿)中NADP+NADPH的提?。?/span>

        NADP+的提取:取血清(漿)體積(mL):酸性提取液體積(mL)為1:5-10的比例,(建議取0.1mL血清(血漿),加入0.5 mL酸性提取液),煮沸5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴冷卻后,10000g4℃離心10min;取200μL上清液,加入200μL堿性提取液使之中和;混勻,10000g 4℃離心 10min,取上清,冰上待測。

        NADPH的提取:取血清(漿)體積(mL):堿性提取液體積(mL)為1:5-10的比例,(建議取0.1mL血清(血漿),加入0.5 mL堿性提取液),煮沸5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴冷卻后,10000g, 4℃離心10min;取200μL上清液,加入200μL酸性提取液使之中和;混勻,10000g 4℃離心 10min,取上清,冰上待測。

        2、組織中NADP+NADPH的提取:

        NADP+的提取:建議取0.1g組織質(zhì)量,加入0.5mL酸性提取液,冰浴研磨,煮沸5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴冷卻后,10000g, 4℃離心10min;取200μL上清液,加入200μL堿性提取液使之中和;混勻,10000g 4℃離心 10min,取上清,冰上待測。

        NADPH的提取:建議取0.1 g組織質(zhì)量,加入0.5 mL堿性提取液,冰浴研磨,煮沸5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴冷卻后,10000g4℃離心10min;取200μL上清液,加入200μL酸性提取液使之中和;混勻,10000g 4℃離心 10min,取上清,冰上待測。

        3、細(xì)胞或細(xì)菌中NADP+NADPH的提取:

        NADP+的提取先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),離心棄上清,建議500萬細(xì)胞或者細(xì)菌加入0.5mL酸性提取液,超聲波破碎(冰浴,功率200W,超聲3s,停10s,重復(fù)30),煮沸5min(蓋緊,以防止水分散失),冰浴冷卻后,10000g4℃離心10min;取200μL上清液,加入200μL堿性提取液使之中和;混勻,10000g 4℃離心 10min,取上清,冰上待測。

        NADPH的提取建議500萬細(xì)胞或者細(xì)菌加入0.5mL堿性提取液,超聲波破碎(冰浴,功率200W,超聲3s,停10s,重復(fù)30),煮沸 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴冷卻后,10000g, 4℃離心10min;取200μL上清液,加入200μL酸性提取液使之中和;混勻,10000g 4℃離心 10min,取上清,冰上待測。

        二、測定步驟

        1、 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上,調(diào)節(jié)波長至450nm,分光光度計蒸餾水調(diào)零。

        2、 NADP+標(biāo)準(zhǔn)品:用蒸餾水稀釋為52.5、1.250.625、0.31250.15625、0nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液0nmol/mL即空白管)。

        3、 NADPH標(biāo)準(zhǔn)品:用蒸餾水稀釋為10、5、2.5、1.250.625、0.3125、0.156250nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液0nmol/mL即空白管)。

        4、 稀釋表(附于說明書最后)

        5、 EP管中按順序加入下列試劑

        試劑名稱(µL

        對照管(A1、A1

        測定管(A2、A2

        標(biāo)準(zhǔn)管

        樣品/標(biāo)準(zhǔn)品

        20

        20

        20

        試劑

        200

        -

        -

        試劑一

        80

        80

        80

        試劑二

        30

        30

        30


        試劑三

        30

        30

        30

         


        試劑四

        30

        30

        30

        充分混勻,室溫避光靜置1h

        試劑


        200

        200

           混勻,取200μL至微量玻璃皿或96孔板中,讀取吸光值,NADP+的記為:ΔA NADP+A2- A1NADPH的記為ΔANADPHA2A1’,NADP標(biāo)準(zhǔn)管的記為ΔA NADP標(biāo)A標(biāo)-A空白管。NADPH標(biāo)準(zhǔn)管的記為ΔA NADPH標(biāo)A標(biāo)-A空白管。(標(biāo)準(zhǔn)曲線只需做1-2,每個測定管需設(shè)一個對照管)。

        三、NADP+NADPH含量計算

        1、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:

        1NADP+標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:

        根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度(x1,nmol/mL)和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)(y1,ΔA標(biāo)準(zhǔn)),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,ΔA測定代入方程得到x1nmol/mL。

        2NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度(x2,nmol/mL)和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)(y2,ΔA標(biāo)準(zhǔn)),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,ΔA′代入方程得到x2nmol/mL

        2、NADP+NADPH含量計算

        (一)NADP+含量計算

        (1) 按液體體積計算:NADP+含量(nmol/mL= x1×V提取+V血清)÷V血清=11×x1

        (2) 按樣本蛋白濃度計算 NADP+ (nmol/mg prot= x1×V提取÷(V提取×Cpr)= x1 ÷ Cpr

        (3) 按樣本鮮重計算NADP+含量(nmol/g質(zhì)量= x1×V提取÷W= x1÷W 

        (4) 按細(xì)胞數(shù)量計算:NADP+含量(nmol/104 cell= x1×V提取÷500=0.002×x1

        (二)NADPH含量計算

        (1) 按液體體積計算:NADPH含量(nmol/mL= x2×V提取+V血清)÷V血清=11×x2

        (2) 按樣本蛋白濃度計算 NADPH (nmol/mg prot= x2×V提取÷(V提取×Cpr)= x2 ÷ Cpr

        (3) 按樣本鮮重計算NADPH含量(nmol/g 質(zhì)量= x2×V提取÷W= x2÷W 

        (4) 按細(xì)胞數(shù)量計算:NADPH含量(nmol/104 cell= x2×V提取÷500=0.002×x2

        V提取:加入提取液體積,1mL;V血清血清(漿)體積0.1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣

        本質(zhì)量,g;500細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500。

        注意事項:

        1、如果一次性測定樣本數(shù)較多,可將試劑一、二、三按比例配成混合液。

        2、反應(yīng)過程中注意避光。

        3、由于每一個測定管需要設(shè)一個對照管,本試劑盒100管可以測定48NADP+NADPH

        4、如果測定吸光值超過線性范圍吸光值,可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進(jìn)行測定。同步修改計算公式。

        實驗實例:

        1. 1NADP+測定:稱取 0.1g冬青葉片,按提取步驟提取后按照測定步驟操作,96孔板測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.075-0.069=0.006,標(biāo)準(zhǔn)曲線y1=0.2081x-0.0144,根據(jù)標(biāo)曲得出x1=0.098NADP+含量得:

        NADP+ (nmol/g 質(zhì)量)= x1÷W=0.98 nmol/g 質(zhì)量。

         

        NADPH測定稱取 0.1g 冬青葉片按提取步驟提取后按照測定步驟操作,96孔板測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.155-0.110=0.045,標(biāo)準(zhǔn)曲線y2=0.0478x-0.0188,根據(jù)標(biāo)曲得出x2=1.335,NADPH含量得:  NADPH (nmol/g 質(zhì)量)= x2÷W=13.35 nmol/g 質(zhì)量。

        2. NADP+測定:稱取 0.1g 小鼠肝臟,按提取步驟提取后按照測定步驟操作,96孔板測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.194-0.146=0.048,標(biāo)準(zhǔn)曲線y1=0.2081x-0.0144,根據(jù)標(biāo)曲得出x1=0.3NADP+含量得:

        NADP+ (nmol/g 質(zhì)量)= x1÷W=2.999nmol/g 質(zhì)量。

        NADPH測定稱取 0.1g 小鼠肝臟按提取步驟提取后按照測定步驟操作,96孔板測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.170-0.141=0.029,標(biāo)準(zhǔn)曲線y2=0.0478x-0.0188,根據(jù)標(biāo)曲得出x2=1,NADPH含量得:

        NADPH (nmol/g 質(zhì)量)= x2÷W=10 nmol/g 質(zhì)量。

        3. NADP+測定0.1mL牛血清,按提取步驟提取后按照測定步驟操作,96孔板測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.077-0.067=0.010,標(biāo)準(zhǔn)曲線y1=0.2081x-0.0144,根據(jù)標(biāo)曲得出x1=0.117,NADP+含量得:

        NADP+ (nmol/mL= 11×x1=1.29 nmol/mL

        NADPH測定0.1mL牛血清,按提取步驟提取后按照測定步驟操作,96孔板測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.084-0.072=0.012,標(biāo)準(zhǔn)曲線y2=0.0478x-0.0188,根據(jù)標(biāo)曲得出x2=0.644,NADPH含量得:

        NADPH (nmol/mL= 11×x2=7.088 nmol/mL

        相關(guān)系列產(chǎn)品:

        BC1100/BC1105  輔酶II NADPH)含量檢測試劑盒(MTT顯色法)

        BC0630/BC0635  NADH氧化酶(NOX)活性檢測試劑盒

        BC1030/BC1035  NAD激酶(NADK)活性檢測試劑盒

        BC0310/BC0315  輔酶I NADH)含量檢測試劑盒(WST-1顯色法)

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