錳過(guò)氧化物酶（Mnp）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書(shū)操作。

貨號(hào)：BC1625

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液配制：

試劑四：臨用前根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需量按照試劑四（μL）：蒸餾水（μL）=1:49的比例配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說(shuō)明：

錳過(guò)氧化物酶（Mnp）（EC1.11.1.13）是一種普遍存在于細(xì)菌和真菌中的微生物木質(zhì)素分解酶，在微生物木質(zhì)素分解系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用，它可以有效的降解木質(zhì)素以及廢水和土壤中比較難降解的化合物，在生物制漿、生物漂白和污染物的生物降解等工業(yè)領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。

錳過(guò)氧化物酶在Mn²⁺環(huán)境下，可將愈創(chuàng)木酚氧化為四鄰甲氧基連酚，四鄰甲氧基連酚在465nm處有吸收峰，通過(guò)檢測(cè)465nm處吸光值的變化，可測(cè)定錳過(guò)氧化物酶的活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、超聲波細(xì)胞破碎儀、可調(diào)式移液器、研缽/勻漿器、微量玻璃比色皿/96孔板、震蕩儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、 組織：按照樣本質(zhì)量（g）：試劑一體積（mL）為1:5~10 的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）加入試劑一，冰浴勻漿；10000g 4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

2、 細(xì)菌或細(xì)胞樣本：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500-1000:1 的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 試劑一）加入試劑一，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率30%或300W，超聲 3s，間隔 7s，總時(shí)間3min），10000g 4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

3、液體樣本：直接檢測(cè)。若溶液渾濁則離心后取上清進(jìn)行測(cè)定。

二、測(cè)定步驟

1、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至465nm，可見(jiàn)分光光度計(jì)需用蒸餾水調(diào)零。

2、測(cè)定前根據(jù)實(shí)驗(yàn)用量取出部分試劑一、試劑二、試劑三和試劑四置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其他動(dòng)物）預(yù)熱10min以上。

3、加樣表（在微量玻璃比色皿/96孔板中依次加入下列試劑)：

    將上述試劑分別加入微量玻璃比色皿/96孔板后迅速吹打混勻，記錄第30s的吸光值A1以及10min30s時(shí)的吸光值A2，計(jì)算ΔA =A2-A1。若一次性測(cè)定樣本過(guò)多，可根據(jù)使用量將試劑一、二、三、四按5:1:2:1比例配成工作液后進(jìn)行預(yù)熱，測(cè)定時(shí)按照20μL樣本+180μL工作液加入微量玻璃比色皿/96孔板進(jìn)行測(cè)定。

三、Mnp活力的計(jì)算

A．用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：

1.按樣本蛋白質(zhì)濃度計(jì)算

酶活定義：pH4.5條件下，每mg組織蛋白每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活單位。

Mnp活性（U/mg prot）= ΔA×V反總÷(?×d)×10⁹÷(V樣×Cpr)÷T= 82.64×ΔA÷Cpr

2.按樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：pH4.5條件下，每mg組織每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活單位。

Mnp活性（U/g 質(zhì)量）= ΔA×V反總÷(?×d)×10⁹÷(V樣÷V樣總×W)÷T= 82.64×ΔA÷W

3.按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：pH4.5條件下，每10⁴細(xì)菌/細(xì)胞每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活單位。

Mnp活性（U/10⁴ cell）= ΔA×V反總÷(?×d)×10⁹÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)÷T= 82.64×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

4.按照樣本體積計(jì)算

酶活定義：pH4.5條件下，每mL血清或液體樣本每分鐘消耗1nmol 底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

Mnp 活性（U/mL）=ΔA×V反總÷(?×d)×10⁹÷V樣÷T= 82.64×ΔA

ε：愈創(chuàng)木酚摩爾消光系數(shù)：12100L/mol/cm；d:比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.0002L；V樣：加入樣本體積，0.02mL，V樣總：提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，10 min；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

B．用96孔UV板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

1.按樣本蛋白質(zhì)濃度計(jì)算

酶活定義：pH4.5條件下，每mg組織蛋白每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活單位。

Mnp活性（U/mg prot）= ΔA×V反總÷(?×d)×10⁹÷(V樣×Cpr)÷T=137.74×ΔA÷Cpr

2.按樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：pH4.5條件下，每g組織每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活單位。

Mnp活性（U/g 質(zhì)量）= ΔA×V反總÷(?×d)×10⁹÷(V樣÷V樣總×W)÷T=137.74×ΔA÷W

3. 按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：pH4.5條件下，每10⁴細(xì)菌/細(xì)胞每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活單位。

Mnp活性（U/10⁴ cell）= ΔA×V反總÷(?×d)×10⁹÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)÷T=137.74×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

4．按照樣本體積計(jì)算

酶活定義：pH4.5條件下，每mL血清或液體樣本每分鐘消耗1nmol 底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

Mnp 活性（U/mL）=ΔA×V反總÷(?×d)×10⁹÷V樣÷T= 137.74×ΔA

ε：愈創(chuàng)木酚摩爾消光系數(shù)：12100 L/mol/cm；d:比色皿光徑，0.6cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.0002L；V樣：加入樣本體積，0.02mL，V樣總：提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，10 min；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

注意事項(xiàng)：

當(dāng)A1大于1.5或者ΔA大于0.6（酶標(biāo)儀ΔA大于0.4）時(shí)，建議將樣本用試劑一稀釋后測(cè)定；當(dāng)ΔA過(guò)小時(shí)，可以適當(dāng)加大樣本量后重新進(jìn)行測(cè)定。注意同步修改計(jì)算公式。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

取0.1002g杏鮑菇加入1mL試劑一進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清置冰上，之后按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算A1=0.055，A2=0.064，ΔA=A2-A1=0.009，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

Mnp 活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA×V反總÷(?×d)×10⁹÷V樣÷T=12.37U/g 質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1] Chowdhary P, Shukla G, Raj G, et al. Microbial manganese peroxidase: a ligninolytic enzyme and its ample opportunities in research[J]. SN Applied Sciences, 2019, 1(1):45.

[2] Rogalski J, Lundell T, Leonowicz A, et al. Production of laccase, lignin peroxidase and manganese-dependent peroxidase by various strains of Trametes versicolor depending on culture conditions[J]. Polish Society of Microbiologists, 1991, 40(3-4):221-234.

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