土壤幾丁質酶活性檢測試劑盒說明書

                                           微量法

注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC1935

規(guī)格：100T/48S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：自備甲苯。

2、 試劑三：懸濁液，使用前搖勻。

3、 試劑四剛從低溫（2-8℃）條件取出會有晶體析出，加熱使其溶解即可。

4、 試劑五：臨用前取1瓶加入12mL試劑五B，充分溶解，現配現用。用不完的試劑2-8℃可以保存4周。

5、 標準液：5mg N-乙酰氨基葡萄糖。臨用前加入1mL試劑二配制成5mg/mL的標準溶液，即5000μg/mL的標準溶液，2-8℃可以保存4周。

產品說明：

幾丁質來源非常豐富，是自然界中僅次于纖維素的第二大類生物高聚物，由于其分解非常緩慢而大量堆積容易造成環(huán)境嚴重污染。幾丁質酶是影響土壤中氮礦化的一種重要的酶，其分解幾丁質控制著氮循環(huán)的關鍵步驟。

幾丁質酶水解幾丁質產生N-乙酰氨基葡萄糖，N-乙酰氨基葡萄糖與堿共熱產生的中間化合物可進一步與對二甲氨基苯甲醛反應產生顯色物質，該顯色物質在585nm處有特征吸收峰，吸光值增加速率反映了幾丁質酶的活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、可調式移液器、旋渦振蕩混勻儀、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽、30-50目篩、蒸餾水與甲苯（不允許快遞）、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

新鮮土樣風干，過30-50目篩。 稱取約0.1g土樣，加入0.05mL試劑一，混勻，常溫靜置15min。靜置結束后，加入0.2mL試劑二與0.4mL試劑三，37℃振蕩反應24h，8000rpm，4℃離心10min（若離心后上清中仍有雜

質，建議將上清再次離心，至澄清），取上清液置于冰上待測。

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至585nm，分光光度計用蒸餾水調零。

2、 標準品溶液的配制：臨用前將5000μg/mL的標準溶液用試劑二稀釋80倍至62.5 μg/mL標準溶液備用。取25μL 5000μg/mL的標準溶液，加1975μL試劑二，充分混勻，配制成62.5μg/mL標準液使用，現用現配。（實驗中每管需要100μL，為減小實驗誤差，故配制大體積。）

3、 在EP管中進行以下操作：

三、土壤幾丁質酶活性計算

酶活性定義：37℃條件下，每克土壤每天分解幾丁質產生1μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活性單位。

土壤幾丁質酶活性（U/g 土樣）=（ΔA測定÷ΔA標準×C標）×V反總÷W÷T=40.625×ΔA測定 ÷ΔA標準÷W

C標：標準管的濃度，62.5μg/mL；V反總：樣本處理總體積，0.65mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，1d。

注意事項：

1. 反應結束后立即進行比色。

2. 試劑五有一定的毒性，試驗操作時做好個人防護。

3. 當A測定大于1時，建議將樣本上清液用試劑二稀釋后再進行測定。

實驗實例：

1、 取0.1g土樣1按照測定步驟操作，用96孔板測得數據后計算ΔA測定=A測定-A對照=0.098-0.051=0.047，ΔA標準=A標準- A空白=0.612-0.049=0.563。根據公式計算酶活得：

土壤幾丁質酶活性（U/g 土樣）=40.625×ΔA測定÷ΔA標準÷W= 40.625×0.047÷0.563÷0.1=33.9 U/g 土樣。

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