羥*氨酸（HYP）含量檢測試劑盒說明書
微量法
貨號：BC0255
規(guī)格：100T/96S
產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 提取液：自備6 mol/L鹽酸溶液，大約需要200mL，常溫保存；試劑盒內(nèi)提供一個30mL棕色空瓶，僅做分裝使用，請自行標(biāo)注試劑名稱

2. 6 mol/L鹽酸提取液的配制：按濃鹽酸（37%）和H₂O的體積比是1：1進行配制。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品：0.5 mg/mL羥*氨酸標(biāo)準(zhǔn)品。

產(chǎn)品說明：
HYP是機體膠原蛋白主要成分之一，膠原蛋白大多分布于皮膚、腱、軟骨和血管等，因此HYP含量是反映膠原組織代謝及纖維化程度的一項重要指標(biāo)。
樣本經(jīng)水解產(chǎn)生游離的HYP，進一步被氯胺T氧化，氧化產(chǎn)物與對二甲*甲醛反應(yīng)，產(chǎn)生紅色化合物，在560nm處有特征吸收峰。通過測定樣本水解液560nm吸光值，可計算HYP含量。

技術(shù)指標(biāo)：
低檢出限：0.057 μg/mL
線性范圍：0.234-30 μg/mL
注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
天平、玻璃管、離心機、水浴鍋、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、6mol/L鹽酸、*溶液和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產(chǎn)品資料"附件
注意事項：

1. 如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者用蒸餾水稀釋樣本后再進行測定。

2. 試劑有一定的毒性，請操作時做好防護措施，防止吸入或與皮膚接觸。

3. 按樣本蛋白濃度計算時，需單獨提取樣本中的蛋白質(zhì)并測定。

實驗實例：

1. 取0.2g小鼠皮膚進行樣本處理，取上清后蒸餾水稀釋32倍后按測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定=A測定管-A空白管=0.375-0.123=0.252，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0344x+0.015，R²=0.9975，計算x=6.89，按樣本質(zhì)量計算含量得：

組織羥*氨酸含量（µg/g 質(zhì)量）=4x÷W×32（稀釋倍數(shù)）=4×6.89÷0.2×32=4409.6 µg/g 質(zhì)量。

1. 取8×10⁶個HMC-1細胞進行樣本處理，取上清后按測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定=A測定管-A空白管=0.183-0.126=0.057，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0344x+0.015，R²=0.9975，計算x=1.22，按細胞數(shù)量計算含量得：

細胞羥*氨酸含量（µg/10⁶ cell）=2x÷N=2×1.22÷8=0.305 µg/10⁶ cell。

1. 取300μL牛血清進行樣本處理，取上清后按測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定=A測定管-A空白管=0.194-0.123=0.071，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0344x+0.015，R²=0.9975，計算x=1.63，按液體體積計算含量得：

液體羥*氨酸含量（µg/mL）=6.67×x=6.67×1.63=10.87 µg/mL。

參考文獻：

1. Naeini A, Miri R, Shafiei N. et al. Effects of topical application of Calendula officinalis gel on collagen and hydroxyproline content of skin in rats[J]. Comparative Clinical Pathology, 2012, 21: 253-257.

2. Ignat’eva N, Danilov N, Averkiev S. et al. Determination of hydroxyproline in tissues and the evaluation of the collagen content of the tissues[J]. Journal of Analytical Chemistry, 2007, 62: 51-57.

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